鞣花酸對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂作用的影響及機(jī)理研究.pdf

1、目的：按照轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的理念，本項(xiàng)研究擬以肥胖為切入點(diǎn)，開(kāi)展脂肪細(xì)胞成脂過(guò)程研究，探索干預(yù)成脂的靶點(diǎn)。故本文旨在通過(guò)調(diào)查新疆維吾爾族和哈薩克族人群中心性肥胖患病率，確定肥胖的切入點(diǎn)；并在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞模型中觀察鞣花酸對(duì)脂肪形成的作用，并探討其機(jī)制。試圖將肥胖這一臨床表象與成脂的基礎(chǔ)研究相結(jié)合，為防治代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的干預(yù)靶點(diǎn)，并為開(kāi)發(fā)新疆地產(chǎn)石榴皮作為減肥植物資源提供可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，

2、納入1,379名維吾爾族和1,123名哈薩克族志愿者，年齡30～70歲，禁食8～12小時(shí)后，采集血液，并進(jìn)行體征指標(biāo)測(cè)量和生化指標(biāo)檢測(cè)。觀察兩民族中心性肥胖患病率。數(shù)據(jù)處理采用χ2檢驗(yàn)及t-檢驗(yàn)，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理。為觀察鞣花酸在3T3-L1脂肪前體細(xì)胞系中對(duì)終末成脂的影響，我們采用以下方法：用臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞拒染實(shí)驗(yàn)觀察鞣花酸對(duì)脂肪細(xì)胞活力的影響；WST-1染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察誘導(dǎo)前后3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的增

3、殖；PI和ANNEXIN-V雙染觀察鞣花酸對(duì)誘導(dǎo)前后3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡的影響；Oil red O染色觀察鞣花酸對(duì)生脂激素及促有絲分裂復(fù)合物（三甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松和胰島素）作用下3T3-L1脂肪前體細(xì)胞脂肪形成的影響；在誘導(dǎo)不同時(shí)間段加入鞣花酸，Oil red O染色觀察鞣花酸影響脂肪形成的最佳作用時(shí)間窗；western blott法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（cyclinA，CDK2，phospho-Rb/total-Rb和

4、C/EBPβ及C/EBPβThr188磷酸化）以及脂肪細(xì)胞特異性蛋白（C/EBPα，PPARγ和aP2）的表達(dá)，初步探討鞣花酸影響脂肪形成的作用機(jī)制；PI單染流式細(xì)胞術(shù)觀察誘導(dǎo)后24小時(shí)內(nèi)，鞣花酸對(duì)3T3-L1脂肪前體細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響；EdU和Hoechst33342雙染熒光顯微鏡下觀察進(jìn)入S期細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步驗(yàn)證鞣花酸對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的作用；提取3T3-L1脂肪前體細(xì)胞核蛋白用TRANS Active Motif ELISA試劑

5、盒檢測(cè)鞣花酸對(duì)C/EBPβ和C/EBPαDNA結(jié)合活性的影響；Luciferase雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)鞣花酸對(duì)C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活的作用；最后用Realtime PCR和western blott檢測(cè)C/EBPβ靶基因和靶蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步闡述鞣花酸對(duì) C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活作用的影響。數(shù)據(jù)處理采用方差分析及t-檢驗(yàn)，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理。
　　結(jié)果：維吾爾族和哈薩克族中心性肥胖患病率為51.6％和50.

6、8%，差異無(wú)顯著性。均衡年齡和性別后，維吾爾族高甘油三酯血癥患病率高于哈薩克族，分別為53.6%和24.1%（P＜0.05），而高密度脂蛋白減低血癥患病率也高于哈薩克族，分別為49.1%和12.1%（P＜0.05）。鞣花酸不影響3T3-L1脂肪前體細(xì)胞活力；與對(duì)照組相比可時(shí)間-濃度依賴(lài)性地抑制誘導(dǎo)前后前體脂肪細(xì)胞增殖；鞣花酸對(duì)生脂激素及促有絲分裂復(fù)合物誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的3T3-L1脂肪前體細(xì)胞均無(wú)促凋亡作用；但鞣花酸可濃度依賴(lài)的抑制3T3

7、-L1脂肪細(xì)胞脂肪形成，抑制脂肪形成主要通過(guò)影響脂肪形成的早期發(fā)揮作用；鞣花酸抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（cyclinA，phospho-Rb/total-Rb和C/EBPβ Thr188磷酸化）的表達(dá)，對(duì) CDK2，C/EBPβ總蛋白表達(dá)無(wú)影響；鞣花酸也抑制脂肪細(xì)胞特異性蛋白（C/EBPα，PPARγ和aP2）的表達(dá)；另外，鞣花酸可時(shí)間-濃度依賴(lài)地抑制進(jìn)入 S期的3T3-L1脂肪前體細(xì)胞數(shù)量，將3T3-L1脂肪前體細(xì)胞阻滯在G1期；實(shí)驗(yàn)結(jié)果

8、還發(fā)現(xiàn)鞣花酸抑制生脂激素及促有絲分裂復(fù)合物誘導(dǎo)后24h C/EBPβ和以及36h和48h的C/EBPαDNA結(jié)合活性；Luciferase雙熒光素酶報(bào)告基因法揭示鞣花酸可抑制C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活活性；并且抑制 C/EBPβ靶基因（C/EBPα和PPARγ）和靶蛋白（C/EBPα和PPARγ）的表達(dá)，更進(jìn)一步證明鞣花酸抑制C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　結(jié)論：新疆維吾爾和哈薩克族肥胖患病率高，且合并脂代謝紊亂，這可能是導(dǎo)致代謝性疾病