黃連五種單體對3T3-L1脂肪細(xì)胞代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的
　　 糖尿病是由于體內(nèi)胰島素絕對或相對不足所致的一種內(nèi)分泌代謝性疾病，常伴有高脂血癥。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，糖尿病屬消渴病的范疇，歷代醫(yī)書記載了大量治療消渴病的中藥及方劑，目前研究發(fā)現(xiàn)這些中藥方劑大部分含有黃連或其主要成分黃連生物堿。黃連為毛莨科多年生草本植物，其根莖具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，黃連的降糖調(diào)脂作用主要與其根莖所含的生物堿小蘗堿、藥根堿、表小蘗堿、巴馬汀、黃連堿等有關(guān)。小蘗堿是目前研究最多的

2、黃連生物堿，具有改善高脂血癥和胰島素抵抗等作用。化學(xué)分析顯示藥根堿、表小蘗堿、巴馬汀、黃連堿均是異喹啉生物堿，為小蘗堿的同系物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與小蘗堿相似，有文獻(xiàn)報(bào)道它們具有和小蘗堿相似的生物學(xué)功能，但目前為止其作用機(jī)制尚不清楚。
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，與配體結(jié)合后轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生變化

3、，從而導(dǎo)致PPARs靶基因表達(dá)的改變，進(jìn)而引起脂肪生成、脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、糖耐量受損、肥胖等一系列生理活動。肝X受體a(Liver X recepetor aphal，LXR a)的靶基因已發(fā)現(xiàn)了十幾種，其中大部分與糖代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及脂質(zhì)代謝有密切關(guān)系，提示LXR a可能廣泛參與了脂質(zhì)代謝紊亂、2型糖尿病及動脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　 本研究以3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對象，分別檢測黃連五種單體對其葡萄

4、糖攝取和脂肪酸氧化的影響，以及黃連單體處理脂肪細(xì)胞后PPARs、LXRα基因和蛋白表達(dá)的變化情況，以期明確黃連單體對糖脂代謝的可能作用機(jī)制，為黃連生物堿的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞按照ATCC推薦的方法培養(yǎng)，細(xì)胞長滿6孔板后加入IBMX(終濃度0.5mmol/L)、地塞米松(終濃度1μmol/L)、胰島素(終濃度10mg/L)誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。分化成熟的脂肪細(xì)胞采用油紅O染色

5、的方法進(jìn)行鑒定。
　　 2、將分化成熟的脂肪細(xì)胞接種于96孔板，用黃連五種單體誘導(dǎo)細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，濃度分別為265.65μmol/L、53.75μmol/L、10.75μmol/L、2.15μmol/L、0.45μmol/L，采用空白組和PBS組作為對照組，吞噬MTT后檢測其OD值，每組至少重復(fù)3孔。
　　 3、五種單體均選用最適濃度處理3T3-L1脂肪細(xì)胞，PBS處理組作為陰性對照共培養(yǎng)48

6、h，[3H]2-DG不蹤檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，14C-palmitic示蹤檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂肪酸氧化情況。
　　 4、選用黃連五種單體的最適濃度處理細(xì)胞48h，采用空白組和PBS組作為對照組，Real-time PCR檢測其PPARs和LXRα基因表達(dá)情況，western blot檢測其PPARs和LXRα蛋白表達(dá)的情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和

7、鑒定實(shí)驗(yàn)：3T3-L1前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化為3T3-L1脂肪細(xì)胞的過程中，胞漿中脂肪滴有無到有，由小變大，細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，在誘導(dǎo)分化至第9-10天左右分化成熟，采用油紅O染色后胞漿中脂肪滴被染成紅色。
　　 2、MTT檢測結(jié)果：五種單體的最佳作用時(shí)間均為48h，小蘗堿、表小蘗堿的最佳作用濃度均為2.15μmol/L，巴馬汀、黃連堿的最佳作用濃度均為10.75μmol/L，藥根堿的最佳作用濃度為0.45μmol/L。
　　

8、 3、3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的結(jié)果：實(shí)驗(yàn)顯示胰島素有明顯促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的作用；小蘗堿、表小蘗堿和巴馬汀在胰島素介導(dǎo)作用下均有促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的作用；藥根堿和黃連堿對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化的結(jié)果：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示小蘗堿和藥根堿處理組均具有促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化的作用；表小蘗堿、巴馬汀和黃連堿處理組均對3T

9、3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、黃連五種單體對3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARs和LXRα基因和蛋白表達(dá)影響：
　　 (l)Real-time PCR結(jié)果：與PBS對照組相比，黃連五種單體作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞后均具有促進(jìn)PPARα和PPARβ基因表達(dá)的作用；小蘗堿、藥根堿還可促進(jìn)LXRα的基因表達(dá)，而小蘗堿、表小蘗堿、巴馬汀對PPARγ的基因表達(dá)與PBS對照組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

10、 (2)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果：與PBS對照組相比，小蘗堿和表小蘗堿處理組能夠明顯促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARs和LXRa的蛋白表達(dá)水平；藥根堿處理組能夠顯著上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARα、PPARβ和LXRα的蛋白表達(dá)水平；而巴馬汀處理組對3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARβ和PPARγ蛋白表達(dá)水平具有促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、MTT實(shí)驗(yàn)顯示黃連五種單體對3T3-L1脂肪細(xì)胞的最佳作用時(shí)間均為48h，小蘗堿、表小

11、蘗堿的最佳作用濃度均為2.15μmol/L，巴馬汀、黃連堿的最佳作用濃度均為10.75μmol/L，藥根堿最佳作用濃度為0.45μmol/L。
　　 2、小蘗堿、表小蘗堿和巴馬汀均可促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，小蘗堿的作用機(jī)制可能與增加PPARs和LXRα基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)；表小蘗堿和巴馬汀可能是通過上調(diào)PPARα、PPARβ和PPARγ表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　 3、小蘗堿和藥根堿對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化具