白藜蘆醇對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡與分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、脂肪組織在人體中是一個(gè)重要的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器，脂肪蓄積過多可能導(dǎo)致胰島素抵抗，這是包括2型糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓病等代謝綜合征發(fā)病的“共同土壤”。機(jī)體的脂肪含量是由脂肪細(xì)胞的體積和數(shù)目決定的。在分化成熟的脂肪細(xì)胞中，增加TG儲(chǔ)存可以導(dǎo)致細(xì)胞體積的增大，而脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加則是由于前脂肪細(xì)胞過度增殖及分化造成的。因此，減少機(jī)體脂肪含量的方法包括降低脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量(通過影響脂肪合成或脂肪分解)，或抑制前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分

2、化，或促進(jìn)前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的凋亡。傳統(tǒng)的減肥方法主要是減少能量攝入和增加體育鍛煉而降低脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量，而傳統(tǒng)方法減肥成功者只是脂肪細(xì)胞變小而數(shù)量不變，這些方法獲得的體重減輕往往難于長(zhǎng)期持續(xù)，甚至可能出現(xiàn)體重反彈，因此，能否通過其它更好的途徑來防治肥胖成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 脂肪細(xì)胞起源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，經(jīng)過MSCs→前脂肪細(xì)胞(Preadipocytes)→成

3、熟脂肪細(xì)胞→脂解作用(Lipolysis)→凋亡，完成整個(gè)生命周期。在脂肪細(xì)胞的生命周期中，MSCs首先形成為前脂肪細(xì)胞，前脂肪細(xì)胞經(jīng)過生長(zhǎng)抑制、克隆性增殖和一系列基因表達(dá)的變化，細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸增加，進(jìn)而形成成熟脂肪細(xì)胞。在脂肪分化過程中，過氧化物增殖體激活受體γ(PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)是調(diào)節(jié)脂肪形成最主要的轉(zhuǎn)錄因子。脂肪細(xì)胞在生命周期的后期進(jìn)入凋亡階段，細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和更新的程序性死亡過程。凋亡

4、的啟動(dòng)和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制比較復(fù)雜，主要是通過死亡受體途徑(Death receptor)和線粒體途徑。線粒體-半胱天冬氨酸酶(Caspase)家族途徑在前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的凋亡過程中起關(guān)鍵作用。外界因素作用于細(xì)胞信號(hào)分子，引起線粒體膜電位的改變，細(xì)胞色素C釋放增加，激活Caspase依賴的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。在脂肪細(xì)胞的整個(gè)生命周期中，調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞或成熟脂肪細(xì)胞的凋亡，這對(duì)于減少脂肪細(xì)胞數(shù)目和體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存具

5、有重要意義。
　　 大量研究顯示，植物化學(xué)活性物質(zhì)對(duì)于肥胖具有防治作用。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是其中一種已被廣泛研究的植物化學(xué)物，廣泛存在于葡萄、花生、葡萄酒和其它天然植物或果實(shí)當(dāng)中，具有廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)。Res的生物學(xué)效應(yīng)包括抗炎癥、抗氧化、抗白血病、神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)可作為腫瘤化學(xué)治療和化學(xué)預(yù)防的藥物。在多種類型的腫瘤細(xì)胞中，Res可促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而且有研究發(fā)現(xiàn)，Res可

6、抑制前脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪的合成，并且可促進(jìn)分化成熟脂肪細(xì)胞的凋亡。然而，Res對(duì)于前脂肪細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制仍未明確。本文推測(cè)Res可能影響脂肪細(xì)胞生命周期各階段，從而對(duì)肥胖及代謝綜合征有預(yù)防和治療作用。
　　 目的：
　　 1、研究并探討Res對(duì)前脂肪細(xì)胞的凋亡作用及可能機(jī)制。
　　 2、研究并探討Res對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用及可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、Res對(duì)

7、前脂肪細(xì)胞的凋亡作用。
　　 (1)培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用WST-1染色法測(cè)定Res對(duì)細(xì)胞增殖的影響，通過LDH漏出率實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Res對(duì)細(xì)胞膜的損傷作用。用Hoechst 33258染色細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察Res對(duì)細(xì)胞核的作用，在透射電子顯微鏡下觀察Res對(duì)細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)的改變。用流式細(xì)胞儀測(cè)定藥物作用后細(xì)胞周期、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率的改變。
　　 (2)用免疫細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)Sirt1、Survivin

8、進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的定位，在熒光顯微鏡下觀察Res對(duì)Sirt1蛋白表達(dá)的影響。用Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定Res作用后Sirt1、p-AMPK、AMPK、p-AKT、AKT、Survivin、Cyt C、Cleaved Caspase 9和Caspase 3蛋白的表達(dá)變化。
　　 (3)添加相關(guān)位點(diǎn)(Sirt1、AMPKα、Survivin)的siRNA或特異性抑制劑(Wortmannin、Z-LEHD-FMK、Z-DEVD-FM

9、K)或激動(dòng)劑(AICAR)，用WST-1法測(cè)定細(xì)胞增殖的變化，用流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率的變化，用Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定Sirt1、p-AMPK、p-AKT、Survivin、Cyt C、Cleaved Caspase 9和Caspase 3蛋白的表達(dá)變化。
　　 2、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。
　　 (1)用“雞尾酒”方法誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞分化過程的形態(tài)學(xué)

10、變化，用油紅O染色比色法測(cè)定細(xì)胞分化過程中脂肪含量的變化。
　　 (2)用Real time PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定細(xì)胞分化不同時(shí)間點(diǎn)Sirt1、PPARγ、C/EBPα的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化。
　　 3、Res對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。
　　 (1)在光學(xué)顯微鏡下觀察Res對(duì)細(xì)胞分化過程中形態(tài)學(xué)的改變，用油紅O染色比色法測(cè)定Res對(duì)細(xì)胞分化過程脂肪含量的改變。

11、　　 (2)用Real time PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定Res作用后脂肪細(xì)胞的Sirt1、PPARγ、C/EBPα的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化，同時(shí)測(cè)定脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素和瘦素的mRNA表達(dá)變化。
　　 (3)觀察NAM對(duì)細(xì)胞分化過程形態(tài)學(xué)的改變，測(cè)定NAM對(duì)細(xì)胞分化過程脂肪含量的改變。用Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定NAM作用后脂肪細(xì)胞的Sirt1、PPARγ、C/EBPα蛋白的表達(dá)變化。
　　

12、 結(jié)果：
　　 1、Res對(duì)前脂肪細(xì)胞的凋亡作用。
　　 (1)Res抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖，增加LDH漏出率，具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)(P＜0.01)。經(jīng)過Res作用后，細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝集，甚至出現(xiàn)DNA斷裂，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也有改變，線粒體腫脹，疏松變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞漿出現(xiàn)大量的空泡。Res作用后細(xì)胞周期出現(xiàn)S期阻滯，線粒體膜電位明顯下降，細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 (2)

13、Sirt1蛋白在3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，Survivin蛋白僅在細(xì)胞漿中表達(dá)。Res作用后細(xì)胞的Sirt1、p-AMPK、CytC(Cyto)、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3蛋白表達(dá)上升，p-AKT、Survivin蛋白表達(dá)下降，AMPK、AKT、Cyt(Total)的蛋白表達(dá)無明顯變化。
　　 (3)Sirt1siRNA干擾后前脂肪細(xì)胞增殖能力上升，線粒體膜電位

14、升高，細(xì)胞凋亡率下降(P＜0.05或P＜0.01)，Sirt1、p-AMPK、CytC(Cyto)、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3蛋白表達(dá)下降，p-AKT、Survivin蛋白表達(dá)上升，說明Res通過激活Sirt1而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且Sirt1位于其它蛋白上游。通過AMPKα、SurvivinsiRNA干擾或特異性抑制劑(Wortmannin、Z-LEHD-FMK、Z-DEVD-FMK)或激動(dòng)劑(AICAR

15、)做相關(guān)處理，證實(shí)Sirt1可通過激活A(yù)MPK，或抑制AKT磷酸化從而抑制Survivin表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CytC從線粒體釋放到胞漿，依次激活Caspase 9和Caspase 3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 2、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。
　　 (1)3T3-L1前脂肪細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣形狀，多為梭形或多角形，胞漿中無脂滴。隨著細(xì)胞分化的進(jìn)展，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴逐漸增多，細(xì)胞的形態(tài)由多角形變?yōu)闄E圓形或圓形，小脂滴大量融合

16、成大脂滴，細(xì)胞核被推向細(xì)胞的邊緣，成為成熟的脂肪細(xì)胞，細(xì)胞的相對(duì)脂肪含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯升高(P＜0.01)。
　　 (2)與前脂肪細(xì)胞相比，分化過程不同時(shí)間點(diǎn)Sirt1、PPARγ和C/EBPα的mRNA表達(dá)水平上升(P＜0.01)。Western blot檢測(cè)結(jié)果與之變化趨勢(shì)一致。
　　 3、Res對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。
　　 (1)Res作用后分化成熟的脂肪細(xì)胞數(shù)目明顯減少，Res對(duì)細(xì)胞分

17、化的抑制率隨著劑量增加而升高(P＜0.01)。
　　 (2)與對(duì)照組相比，Res組脂聯(lián)素和瘦素mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著Res劑量的增加，脂肪細(xì)胞Sirt1的mRNA水平逐漸升高，而PPARγ、C/EBPα的mRNA水平逐漸下降(P＜0.01)，Western blot檢測(cè)結(jié)果與之變化趨勢(shì)一致。
　　 (3)NAM作用后細(xì)胞分化能力上升，與對(duì)照組相比，NAM組Sirt1蛋白表達(dá)下降，而P

18、PARγ、C/EBPα蛋白表達(dá)升高。
　　 結(jié)論：
　　 1、Res抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 2、Res激活Sirt1，增加AMPK磷酸化水平，并可降低AKT磷酸化而抑制Survivin表達(dá)，兩條通路均可促進(jìn)CytC釋放到胞漿，激活Caspase 9和Caspase 3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 3、Res抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，機(jī)制是通過激活Sirt1而抑制PPARγ