低劑量雙酚A通過(guò)PPARγ促進(jìn)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的研究.pdf

1、研究背景：
　　在近幾十年里，肥胖患病率全球性快速增加，并呈現(xiàn)持續(xù)升高的狀態(tài)?？茖W(xué)界提出了“環(huán)境致肥胖因子”的假說(shuō)，環(huán)境致肥胖因子是指能夠引起脂質(zhì)代謝、脂肪儲(chǔ)存、代謝定位點(diǎn)和能量平衡異常，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)積累與肥胖的化學(xué)物質(zhì)。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A（BPA）是一種環(huán)境致肥胖因子，人類可經(jīng)消化道、呼吸和皮膚接觸等途徑暴露BPA。BPA能潛在地影響脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程和脂肪組織的生物學(xué)功能。很多研究表明低劑量BPA不僅

2、能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，也能干擾脂肪細(xì)胞分泌脂肪因子和炎癥因子，這對(duì)肥胖的炎性病理狀態(tài)的形成有一定的作用。然而BPA暴露對(duì)脂肪細(xì)胞的分化及其對(duì)脂肪因子和炎癥因子的調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。
　　研究目的：
　　通過(guò)檢測(cè)低劑量BPA對(duì)分化過(guò)程中的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞增殖率，脂質(zhì)沉積，脂肪因子、炎癥因子以及C/EBP和PPARγ的表達(dá)影響，探討低劑量BPA對(duì)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及其轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響；小鼠3T3-L

3、1前脂肪細(xì)胞用PPARγ激動(dòng)劑和抑制劑預(yù)處理后用BPA處理6天，檢測(cè)細(xì)胞中脂質(zhì)沉積、脂肪因子和炎癥因子分泌，探討PPARγ在BPA促進(jìn)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　研究方法：
　　體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞90％融合后，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基A培養(yǎng)2天，換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B培養(yǎng)至第8天結(jié)束。在開始誘導(dǎo)分化時(shí)持續(xù)用10 nmol/L、100 nmol/L或1000 nmol/L的BPA處理細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照和

4、DMSO溶劑組。在誘導(dǎo)分化第2、4、6、8天，用CCK8測(cè)細(xì)胞活率，油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，ELISA法分析培細(xì)胞上清脂肪因子（瘦素、脂聯(lián)素）和炎性因子（TNF-α、IL6、IL1β）的水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6、IL-1β、PPARγ和C/EBP mRNA水平，免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)。
　　PPARγ對(duì)BPA促進(jìn)小鼠前脂肪細(xì)胞分化影響研究中，用1000 nmol/

5、L BPA處理細(xì)胞時(shí)用PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮或抑制劑GW9665同時(shí)處理細(xì)胞，誘導(dǎo)分化至第6天；油紅O染色法分析脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積，ELISA分析上清中脂肪因子和炎性因子水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中脂肪因子、炎性因子、PPARγ和C/EBP的mRNA表達(dá)水平，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行錄入和統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.低劑量BPA對(duì)分化過(guò)程中的小鼠3T3-L

6、1前脂肪細(xì)胞活率和脂質(zhì)沉積的影響
　　1.1對(duì)細(xì)胞活率的影響 CCK8結(jié)果顯示，與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組相比，誘導(dǎo)分化第2天，1000 nmol/L BPA組細(xì)胞活率顯著增強(qiáng)；誘導(dǎo)分化第4、6、8天，BPA處理組細(xì)胞活率下降；第6天時(shí)，1000 nmol/L BPA組細(xì)胞活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第8天時(shí)，100 nmol/L BPA組和1000 nmol/L BPA組細(xì)胞活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.2對(duì)脂質(zhì)沉積的影

7、響油紅O染色顯示，與空白對(duì)照組相比，BPA處理組細(xì)胞內(nèi)脂滴含量增多；定量分析顯示，與空白對(duì)照組相比，第6天和第8天時(shí)，100 nmol/L BPA和1000 nmol/L BPA處理組脂滴明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.低劑量BPA對(duì)分化過(guò)程中的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞的脂肪因子和細(xì)胞因子分泌的影響
　　與空白對(duì)照組相比，第4天時(shí)，1000 nmol/L BPA處理組上清中瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和

8、細(xì)胞中mRNA表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第6天和第8天時(shí)，100 nmol/L BPA和1000 nmol/L BPA處理組瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和mRNA表達(dá)明顯升高，而脂聯(lián)素因子水平和mRNA表達(dá)下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.低劑量BPA對(duì)分化過(guò)程中的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中PPARγ和C/EBP表達(dá)的影響
　　與空白對(duì)照組相比，第4天時(shí)，1000 nmol/L BPA處理組細(xì)胞中P

9、PARγ和C/EBP mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第6天和第8天時(shí)，100 nmol/L BPA和1000 nmol/L BPA組PPARγ和C/EBP mRNA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　免疫組化檢測(cè)顯示PPARγ在細(xì)胞核周圍表達(dá)，與空白對(duì)照組相比，BPA處理組PPARγ表達(dá)增強(qiáng)。
　　4. PPARγ對(duì)BPA促進(jìn)小鼠前脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控
　　4.1 PPARγ激動(dòng)劑對(duì)BPA促進(jìn)小鼠3T3-L1前脂肪

10、細(xì)胞分化的影響
　　與空白對(duì)照組相比，羅格列酮組和羅格列酮+1000 nmol/L BPA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯增多，定量分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和細(xì)胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達(dá)均上升，而上清中脂聯(lián)素水平和細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與1000 nmol/L BPA組相比，羅格列酮+1000 nmol/L BPA組細(xì)胞內(nèi)脂

11、質(zhì)沉積增多，定量分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6水平和細(xì)胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達(dá)均上升，而上清中脂聯(lián)素水平和細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與羅格列酮組相比，羅格列酮+1000 nmol/L BPA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增多，定量析顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6的表達(dá)升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ

12、mRNA基因表達(dá)和PPARγ蛋白的表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.2 PPARγ抑制劑對(duì)BPA促進(jìn)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響
　　與空白對(duì)照組相比，GW9665組和GW9665+1000 nmol/L BPA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少，定量分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和細(xì)胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達(dá)均下降，而上清中脂聯(lián)素水

13、平和細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與1000 nmol/L BPA組相比，GW9665+1000 nmol/L BPA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少，定量分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6水平和細(xì)胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達(dá)均下降，而上清中脂聯(lián)素水平和細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與GW9665組相比，GW9665+1000 nmol/L

14、BPA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積變化不明顯，定量析顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6的表達(dá)稍升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγmRNA基因表達(dá)和PPARγ蛋白的表達(dá)變化也不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.在體外誘導(dǎo)分化條件下，低劑量BPA促進(jìn)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化成熟，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子C/EBP和PPARγ的表達(dá)，干擾脂肪因子和炎癥因子的表達(dá)。
　　2.