低劑量雙酚A通過PPARγ促進小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化的研究.pdf

1、研究背景：
　　在近幾十年里，肥胖患病率全球性快速增加，并呈現(xiàn)持續(xù)升高的狀態(tài)?？茖W(xué)界提出了“環(huán)境致肥胖因子”的假說，環(huán)境致肥胖因子是指能夠引起脂質(zhì)代謝、脂肪儲存、代謝定位點和能量平衡異常，進而促進脂質(zhì)積累與肥胖的化學(xué)物質(zhì)。越來越多的研究證據(jù)表明環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A（BPA）是一種環(huán)境致肥胖因子，人類可經(jīng)消化道、呼吸和皮膚接觸等途徑暴露BPA。BPA能潛在地影響脂肪細胞的分化過程和脂肪組織的生物學(xué)功能。很多研究表明低劑量BPA不僅

2、能促進脂肪細胞分化，也能干擾脂肪細胞分泌脂肪因子和炎癥因子，這對肥胖的炎性病理狀態(tài)的形成有一定的作用。然而BPA暴露對脂肪細胞的分化及其對脂肪因子和炎癥因子的調(diào)控機制目前還不清楚。
　　研究目的：
　　通過檢測低劑量BPA對分化過程中的小鼠3T3-L1前脂肪細胞的細胞增殖率，脂質(zhì)沉積，脂肪因子、炎癥因子以及C/EBP和PPARγ的表達影響，探討低劑量BPA對小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化及其轉(zhuǎn)錄因子表達的影響；小鼠3T3-L

3、1前脂肪細胞用PPARγ激動劑和抑制劑預(yù)處理后用BPA處理6天，檢測細胞中脂質(zhì)沉積、脂肪因子和炎癥因子分泌，探討PPARγ在BPA促進小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化的調(diào)控作用。
　　研究方法：
　　體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細胞90％融合后，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基A培養(yǎng)2天，換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B培養(yǎng)至第8天結(jié)束。在開始誘導(dǎo)分化時持續(xù)用10 nmol/L、100 nmol/L或1000 nmol/L的BPA處理細胞，并設(shè)空白對照和

4、DMSO溶劑組。在誘導(dǎo)分化第2、4、6、8天，用CCK8測細胞活率，油紅O染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，ELISA法分析培細胞上清脂肪因子（瘦素、脂聯(lián)素）和炎性因子（TNF-α、IL6、IL1β）的水平，實時熒光定量PCR法檢測細胞內(nèi)瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6、IL-1β、PPARγ和C/EBP mRNA水平，免疫組化法檢測細胞中PPARγ蛋白表達。
　　PPARγ對BPA促進小鼠前脂肪細胞分化影響研究中，用1000 nmol/

5、L BPA處理細胞時用PPARγ激動劑羅格列酮或抑制劑GW9665同時處理細胞，誘導(dǎo)分化至第6天；油紅O染色法分析脂肪細胞脂質(zhì)沉積，ELISA分析上清中脂肪因子和炎性因子水平，實時熒光定量PCR法檢測細胞中脂肪因子、炎性因子、PPARγ和C/EBP的mRNA表達水平，免疫組化檢測細胞中PPARγ蛋白表達水平。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行錄入和統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1.低劑量BPA對分化過程中的小鼠3T3-L

6、1前脂肪細胞活率和脂質(zhì)沉積的影響
　　1.1對細胞活率的影響 CCK8結(jié)果顯示，與同時間點空白對照組相比，誘導(dǎo)分化第2天，1000 nmol/L BPA組細胞活率顯著增強；誘導(dǎo)分化第4、6、8天，BPA處理組細胞活率下降；第6天時，1000 nmol/L BPA組細胞活性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；第8天時，100 nmol/L BPA組和1000 nmol/L BPA組細胞活性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1.2對脂質(zhì)沉積的影

7、響油紅O染色顯示，與空白對照組相比，BPA處理組細胞內(nèi)脂滴含量增多；定量分析顯示，與空白對照組相比，第6天和第8天時，100 nmol/L BPA和1000 nmol/L BPA處理組脂滴明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.低劑量BPA對分化過程中的小鼠3T3-L1前脂肪細胞的脂肪因子和細胞因子分泌的影響
　　與空白對照組相比，第4天時，1000 nmol/L BPA處理組上清中瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和

8、細胞中mRNA表達均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；第6天和第8天時，100 nmol/L BPA和1000 nmol/L BPA處理組瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和mRNA表達明顯升高，而脂聯(lián)素因子水平和mRNA表達下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.低劑量BPA對分化過程中的小鼠3T3-L1前脂肪細胞中PPARγ和C/EBP表達的影響
　　與空白對照組相比，第4天時，1000 nmol/L BPA處理組細胞中P

9、PARγ和C/EBP mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；第6天和第8天時，100 nmol/L BPA和1000 nmol/L BPA組PPARγ和C/EBP mRNA水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　免疫組化檢測顯示PPARγ在細胞核周圍表達，與空白對照組相比，BPA處理組PPARγ表達增強。
　　4. PPARγ對BPA促進小鼠前脂肪細胞分化的調(diào)控
　　4.1 PPARγ激動劑對BPA促進小鼠3T3-L1前脂肪

10、細胞分化的影響
　　與空白對照組相比，羅格列酮組和羅格列酮+1000 nmol/L BPA組細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯增多，定量分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和細胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達均上升，而上清中脂聯(lián)素水平和細胞中脂聯(lián)素mRNA表達下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與1000 nmol/L BPA組相比，羅格列酮+1000 nmol/L BPA組細胞內(nèi)脂

11、質(zhì)沉積增多，定量分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6水平和細胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達均上升，而上清中脂聯(lián)素水平和細胞中脂聯(lián)素mRNA表達下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與羅格列酮組相比，羅格列酮+1000 nmol/L BPA組細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增多，定量析顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6的表達升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；細胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ

12、mRNA基因表達和PPARγ蛋白的表達均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.2 PPARγ抑制劑對BPA促進小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化的影響
　　與空白對照組相比，GW9665組和GW9665+1000 nmol/L BPA組細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少，定量分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6、IL-1β水平和細胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達均下降，而上清中脂聯(lián)素水

13、平和細胞中脂聯(lián)素mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與1000 nmol/L BPA組相比，GW9665+1000 nmol/L BPA組細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少，定量分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6水平和細胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγ、C/EBP mRNA表達均下降，而上清中脂聯(lián)素水平和細胞中脂聯(lián)素mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與GW9665組相比，GW9665+1000 nmol/L

14、BPA組細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積變化不明顯，定量析顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義；上清中瘦素、TNF-α、IL-6的表達稍升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；細胞中瘦素、TNF-α、IL-6、PPARγmRNA基因表達和PPARγ蛋白的表達變化也不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.在體外誘導(dǎo)分化條件下，低劑量BPA促進小鼠3T3-L1前脂肪細胞的分化成熟，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子C/EBP和PPARγ的表達，干擾脂肪因子和炎癥因子的表達。
　　2.