蛋白酪氨酸磷酸酶1B在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、一、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)志物檢測(cè)背景和目的： 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞株，目前最常用的前脂肪細(xì)胞株之一，是一種從Swiss 3T3小鼠19天的胚胎中分離克隆獲得的具有脂肪細(xì)胞分化潛力的細(xì)胞株，在融合成單層的情況下具有自發(fā)分化為成熟脂肪細(xì)胞的能力。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖、脂肪含量等細(xì)胞生物學(xué)特性的研究，誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞，摸索培養(yǎng)和誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的

2、最佳條件，為應(yīng)用藥物干預(yù)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖分化以及后期研究3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中基因表達(dá)等奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的復(fù)蘇、體外培養(yǎng)、計(jì)數(shù)以及細(xì)胞凍存； 2、3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化； 3、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細(xì)胞； 4、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse transcription-polymerase chain reaction．R

3、T-PCR)檢測(cè)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisomal proliferation activated receptor-gamma，PPARγ2)基因表達(dá)變化。 結(jié)論： 本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖、脂肪含量等細(xì)胞生物學(xué)特性的研究，摸索出了培養(yǎng)和誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)劑濃度，油紅O染色以及脂肪細(xì)胞中。PPARγ2基

4、因表達(dá)的檢測(cè)均顯示3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟，為應(yīng)用藥物干預(yù)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖分化以及后期研究 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中基因表達(dá)等奠定基礎(chǔ)。 二、3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化中PTP1B表達(dá)變化背景和目的： 作為最早被純化的蛋白酪氨酸磷酸酶之一，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosinephosphatase 1B，PTP1B)一直被認(rèn)為是胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要負(fù)性調(diào)控因子，

5、近年來(lái)更是成為治療肥胖、2型糖尿病等胰島素抵抗相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)。 本研究首次采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞系，通過(guò)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，觀察脂肪細(xì)胞分化成熟過(guò)程中PTP1B表達(dá)變化，為進(jìn)一步揭示PTP1B在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)積聚過(guò)程中的作用提供線(xiàn)索。 方法： 1、3T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化； 2、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細(xì)胞； 3、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) (Reverse transcripti

6、on-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中PTP1B mRNA表達(dá)； 4、采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-FQ PCR)半定量檢測(cè)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中PTP1B mRNA表達(dá)； 5、采用western blot方法檢測(cè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中PTP1

7、B蛋白水平表達(dá)。 結(jié)論： 本研究首次發(fā)現(xiàn)在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟過(guò)程中，PTP1B mRNA及蛋白表達(dá)水平隨著脂肪細(xì)胞分化成熟而逐步減低，至脂肪細(xì)胞完全成熟時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，提示PTP1B對(duì)于脂肪組織分化成熟的直接作用是抑制性的，PTP1B水平降低對(duì)于脂肪細(xì)胞分化成熟，脂質(zhì)積聚則起到了“允許”甚至是“促進(jìn)”作用。 三、腫瘤壞死因子-α及羅格列酮對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中PTP1B表達(dá)的影響背景和

8、目的： 已經(jīng)證實(shí)，除了調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡外，脂肪組織，作為一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官，分泌多種激素和細(xì)胞因子如瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子等，參與了機(jī)體更廣泛、更復(fù)雜、更重要的內(nèi)分泌代謝調(diào)控。越來(lái)越多的研究表明，脂肪細(xì)胞分化異常，而并非僅僅的脂肪組織過(guò)度生成，才是發(fā)生2型糖尿病、高血壓、冠心病等代謝性疾病的罪魁禍?zhǔn)?。與糖尿病、冠心病等密切相關(guān)的中央型肥胖很可能是由于脂肪組織分化異常，無(wú)法產(chǎn)生足夠數(shù)量的正常成熟脂肪細(xì)胞存儲(chǔ)過(guò)多的

9、能量，進(jìn)而將生脂壓力轉(zhuǎn)嫁至肝臟、肌肉等器官，導(dǎo)致脂肪異位沉積，最終誘發(fā)一系列的代謝性疾患。 蛋白酪氨酸磷酸酶1B，由于其可使胰島素受體(InsR)及胰島素受體底物蛋白(IRSs)等的酪氨酸脫磷酸化，一直被認(rèn)為是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控因子。然而，PTP1B在機(jī)體各組織中的作用存在著明顯的組織特異性。在肌肉、肝臟組織中已證實(shí)PTP1B水平降低，可使胰島素受體和胰島素受體底物蛋白磷酸化明顯增強(qiáng)，反映胰島素敏感性的指標(biāo)如胰島素誘導(dǎo)的機(jī)

10、體葡萄糖處置力 (insulin stimulated whole-bodyglucose disposal，ISGD)顯著提升。而對(duì)于脂肪組織而言，PTP1B的作用目前仍不清楚，這些作用與機(jī)體胰島素敏感性之間的關(guān)系，更是不得而知。 為此，本研究采用體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，觀察脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中PTP1B蛋白表達(dá)水平變化，再以羅格列酮和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)分別

11、干預(yù)脂肪細(xì)胞分化成熟過(guò)程并觀察PTP1B蛋白表達(dá)情況，以期了解PTP1B在脂質(zhì)合成和成脂過(guò)程的作用以及羅格列酮及腫瘤壞死因子-α分別影響脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的機(jī)制。 方法： 1、3T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化； 2、油紅O染色法鑒定成熟脂肪細(xì)胞； 3、采用western blot方法檢測(cè)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化三組3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中PTP1B蛋白水平表達(dá)。 4、采用免疫沉淀和wester