表達人源性G250抗體的腺病毒載體的體外實驗研究.pdf

1、目的：檢測Ad5-G250表達的G250全長人源性抗體的生物學活性，及其對腎癌細胞產(chǎn)生的作用，為腎癌的放射性免疫診斷和放射性免疫治療的進一研究及腎癌的治療的研究奠定基礎。
　　方法：1.重組腺病毒Ad5-G250、Ad5-EGFP轉染低代HEK293細胞，大量擴增后進行純化，測定滴度。
　　2.Ad5-G250轉染L-02細胞，分別在3天、5天及7天后ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中抗體的表達量。
　　3.收集細胞培養(yǎng)液，

2、利用純化預裝柱對細胞上清液進行純化。
　　4.Western Blot檢測純化的抗體蛋白的分子量。
　　5.Western Blot檢測純化的抗體能否與細胞的G250蛋白相結合。
　　6.免疫組化法檢測Ad5-G250在體外表達的抗體是否具有生物學活性。
　　7.CCK-8法檢測Ad5-G250對腎癌細胞Ketr-3及ACHN細胞的增殖影響。
　　8.Annexin V-FITC/PI法檢測Ad5-G250

3、對腎癌細胞Kerr-3及ACHN細胞凋亡的影響。
　　結果：1.經(jīng)293細胞擴增、純化后測得病毒Ad5-G250、Ad5-EGFP的滴度分別為6.96×109pfu/ml、9.36×109pfu/ml。
　　2.Ad5-G250轉染L-02細胞，ELSA測定3天、5天和7天的G250mAb表達量分別為(213.14±49.27)ng/ml、(346.67±70.23)ng/ml和(437.25±60.16)ng/ml。

4、>　　3.Western Blot實驗顯示Ad5-G250轉染L-02細胞后能夠表達抗體的輕鏈和重鏈，且輕鏈和重鏈的濃度匹配，說明表達的抗體可以形成完整的全長抗體。
　　4.Western Blot實驗顯示純化的抗體能與表達G250蛋白的Ketr-3和786-O細胞在58KD處出現(xiàn)反應條帶，而不表達G250的ACHN和HK-2細胞則在相應位置無反應條帶。
　　5.細胞免疫組化實驗見Ketr-3細胞膜被染成棕褐色，而ACHN細

5、胞未見著色。
　　6.CCK-8法檢測細胞增殖，腺病毒Ad5-G250對腎癌Ketr-3細胞有抑制作用，而對ACHN細胞的抑制作用不明顯。腺病毒Ad5-G250抑制Ketr-3細胞增殖存在濃度及時間依賴性，隨著濃度的增加及時間的延長，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強。
　　7.AnnexinV-FITC/PI法檢測細胞凋亡，Ad5-G250誘導Ketr-3細胞凋亡的作用和ACHN細胞相比具有統(tǒng)計學差異，P<0.05；Ad5-G2