G250啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)Ki67基因RNA干擾條件增殖型腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、目的: 構(gòu)建G250 啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)Ki67 基因RNA 干擾腫瘤特異性增殖腺病毒載體，以進(jìn)一步了解其在體內(nèi)外殺傷腫瘤的效果。
　　 方法:
　　 1.以質(zhì)粒pSilencer3.1-H1 為模板PCR 出含有H1 啟動(dòng)子的Ki67-shRNA 表達(dá)框（H1-Ki67）。
　　 2. 用BglⅡ酶切含有H1 啟動(dòng)子的Ki67-shRNA 表達(dá)框和pZD55。將酶切產(chǎn)物的基因片段H1-Ki67 插入到經(jīng)BglⅡ酶

2、切的pZD55 載體中，建立了pZD55-Ki67-siRNA 克隆。
　　 3. 用XbaⅠ和EcorⅤ雙酶切pZG250、pZD55-Ki67-siRNA，取pZG250酶切含有G250啟動(dòng)子的小片段和pZD55-Ki67-siRNA酶切大片段連接，構(gòu)建pZD55-G250-Ki67 克隆，將陽(yáng)性鑒定結(jié)果送測(cè)序。
　　 4. 陽(yáng)性重組子最終獲得腺病毒穿梭載體pZD55-G250-Ki67。
　　 5. 將pZ

3、D55-G250- Ki67 與含有腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3 共轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞，9-12d 后出現(xiàn)病毒空斑。
　　 6. 病毒小量擴(kuò)增后提取重組腺病毒的DNA，PCR 鑒定正確者即為條件增殖腺病毒ZD55-G250-Ki67。
　　 7. 鑒定正確后大量擴(kuò)增，氯化銫梯度離心純化，空斑計(jì)數(shù)法測(cè)滴度。
　　 結(jié)果:
　　 1. 酶切分析、PCR 鑒定pZD55-Ki67-siRNA 構(gòu)建成功。