CXCR4啟動子調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒抗前列腺癌細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、前列腺癌是西方國家常見的惡性腫瘤，我國前列腺癌的發(fā)病率雖比西方國家低，但隨著人們生活水平的提高及生活習(xí)慣的改變，近年來前列腺癌發(fā)病率呈不斷上升趨勢，成為影響我國老年男性生活質(zhì)量及預(yù)期壽命的重大疾病。在前列腺癌治療中，盡管大部分前列腺癌在早期治療中療效顯著，但是部分表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲性、易復(fù)發(fā)甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，內(nèi)分泌治療晚期幾乎都出現(xiàn)激素抵抗，治療這些前列腺癌使用現(xiàn)有的治療方式往往會顯得捉襟見肘。近年來，隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，基因治療逐漸成

2、為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。如何使得基因治療對腫瘤的選擇性強(qiáng)，對正常細(xì)胞干擾小，對晚期腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤灶仍有效等理念，越來越受到人們的重視。
　　目前，具有在特定腫瘤細(xì)胞中條件性增殖復(fù)制并最終裂解腫瘤細(xì)胞的條件型溶瘤腺病毒，引起了人們極大關(guān)注，溶瘤病毒用于腫瘤治療的研究發(fā)展非常迅速。溶瘤病毒不但自身在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡，而且通過受感染的細(xì)胞釋放出更多的病毒顆粒，產(chǎn)生一種級聯(lián)放大效應(yīng)，直至腫瘤細(xì)胞被清除。目前

3、已可利用基因工程手段使溶瘤效應(yīng)更加具有特異性和條件性，溶瘤腺病毒可以針對不同腫瘤加載其腫瘤特異性啟動子，使得溶瘤病毒僅在特異的腫瘤組織中保持高活性，發(fā)揮溶解腫瘤細(xì)胞的功效。趨化因子受體CXCR4是近年來腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，趨化因子受體CXCR4屬于趨化因子受體家族，是一個具有352個氨基酸且高度保守受體蛋白，為七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)膜受體，已被證實在多種腫瘤細(xì)胞中高度特異性表達(dá)。目前，已有研究證實CXCR4啟動子在腎癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)

4、腫瘤特異性，這提示CXCR4啟動子極有可能成為前列腺癌基因治療中腫瘤特異性啟動子的候選者。
　　因此，本研究重點(diǎn)評價并比較CXCR4啟動子調(diào)控的條件復(fù)制性腺病毒Ad-CXCR4-E1對前列腺癌細(xì)胞生長抑制的情況，分為如下部分:
　　第一部分 CXCR4在前列腺癌細(xì)胞與前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異
　　目的:觀察趨化因子受體CXCR4在前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3、前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá)，探討趨化因子受體C

5、XCR4在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞系的表達(dá)差異。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3、前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1，通過采用半定量RT-PCR法檢測LNCaP、PC-3、RWPE-1中CXCR4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，Western blot印跡檢測CXCR4在LNCaP、PC-3、RWPE-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:三種細(xì)胞中都可以檢測到CXCR4的表達(dá)，但在前列腺癌細(xì)胞中，CXCR4存在高水平的

6、表達(dá)(p＜0.01)。對于前列腺癌各細(xì)胞之間，CXCR4的表達(dá)水平為LNCaP＞PC-3(P＜0.05)。
　　結(jié)論:通過三種細(xì)胞系的比較，前列腺癌細(xì)胞LNCaP及PC-3中存在CXCR4高表達(dá)，提示前列腺癌細(xì)胞中存在CXCR4特異性高表達(dá)。
　　第二部分 CXCR4啟動子的克隆及其在前列腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄特異性分析
　　目的:評估CXCR4啟動子在前列腺癌細(xì)胞中的特異轉(zhuǎn)錄活性。
　　方法:采用PCR方法擴(kuò)增CXCR

7、4啟動子序列，將其克隆到含有報告基因紅色熒光蛋白的質(zhì)粒載體pDsRed2-1和含有熒光素酶(LUC2)的質(zhì)粒載體pGL4.17，經(jīng)脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3和前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1。熒光顯微鏡下觀察DsRed2的表達(dá)情況，并測定CXCR4啟動子在三種細(xì)胞中的熒光素酶活性。
　　結(jié)果:CXCR4啟動子僅在前列腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出特異的轉(zhuǎn)錄活性，其中LNCaP中啟動子活性高于PC-3(P＜0.05)。前列腺上皮細(xì)胞

8、RWPE-1中幾乎觀測不到DsRed2的表達(dá)。熒光素酶活性表明CXCR4啟動子在前列腺癌細(xì)胞中的活性遠(yuǎn)高于前列腺上皮細(xì)胞(P＜0.001)。
　　結(jié)論:CXCR4啟動子在前列腺癌細(xì)胞中具有較強(qiáng)的特異轉(zhuǎn)錄活性，提示CXCR4啟動子可以作為前列腺癌基因靶向治療的“特異開關(guān)”。
　　第三部分 CXCR4調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒對人前列腺癌細(xì)胞特異性殺傷作用
　　目的:用CXCR4調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒Ad-CXCR4-E1感染

9、人前列腺癌細(xì)胞LNCaP，PC-3及人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1，通過檢測細(xì)胞存活率評價條件復(fù)制性腺病毒對于前列腺癌細(xì)胞的特異性殺傷。
　　方法:采用RT-PCR法從人胚腎293細(xì)胞(HEK293)中擴(kuò)增條件復(fù)制型腺病毒必需的E1區(qū)基因，構(gòu)建含有CXCR4啟動子的條件復(fù)制型腺病毒Ad-CXCR4-E1，感染人前列腺癌細(xì)胞LNCaP，PC-3和正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1。Western blot檢測感染后細(xì)胞E1蛋白的表達(dá)。

10、感染后行細(xì)胞病變試驗、臺盼藍(lán)染色、MTT、結(jié)晶紫染色法及流式細(xì)胞學(xué)檢測，評估重組腺病毒對前列腺癌細(xì)胞生長及殺傷的影響。
　　結(jié)果:質(zhì)粒酶切鑒定及PCR結(jié)果證實成功構(gòu)建了含有CXCR4啟動子和E1區(qū)基因的條件復(fù)制型腺病毒載體Ad-CXCR4-E1，Western blot結(jié)果顯示感染Ad-CXCR4-E1后在高表達(dá)CXCR4的前列腺癌細(xì)胞中E1表達(dá)明顯增高，而在正常前列腺上皮細(xì)胞中，不能檢測到E1的表達(dá)。細(xì)胞病變試驗、臺盼藍(lán)染色、M