重組腺病毒介導的PSMA-4-1BBL轉染樹突狀細胞體外誘導抗前列腺癌的實驗研究.pdf

1、目的
　　 構建pAdxsi-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL兩種重組腺病毒,將其轉染DC構建成DC疫苗,體外實驗觀察此DC疫苗呈遞前列腺特異性膜抗原及活化T細胞的能力是否增強,另用其誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成,觀察其對前列腺癌的治療效果,為下一步應用于體內實驗奠定了基礎。
　　 方法
　　 一、PSMA和4-1BBL腺病毒質粒的構建及鑒定
　　 用Adxsi系統(tǒng)構建攜帶PS

2、MA、4-1BBL基因的復制缺陷型腺病毒載體(pAdxsi-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL)并大量制備。TCID50法測定病毒滴度,并用PCR法鑒定兩種基因的表達。
　　 二、健康志愿者外周血單個核細胞(PBMC)來源的樹突狀細胞體外誘導及其體外感染腺病毒效率的測定
　　 分離健康志愿者外周血PBMC,加入不同細胞因子體外誘導擴增培養(yǎng)DC,培養(yǎng)第5天時分成5組,分別按MOI為50、100、200、3

3、00、400加入Ad-GFP,于12,24,48h熒光倒置顯微鏡下觀察同一MOI下綠色熒光蛋白(GFP)的表達;同時在轉染48h后流式細胞儀(FCM)檢測不同MOI下GFP陽性率,并用PE-7AAD凋亡和壞死試劑盒檢測不同MOI下DC細胞的存活情況,摸索最適MOI。
　　 三、樹突狀細胞感染PSMA/4-1BBL基因重組腺病毒后的免疫功能變化
　　 分離健康志愿者外周血PBMC,加入不同細胞因子體外誘導擴增培養(yǎng)DC、T,

4、按最適MOI,在DC中加入相應的病毒量,分成五組:Ad-PSMA/4-1BBL共轉染DC組、Ad-PSMA-DC組、Ad-4-1BBL-DC組、Ad-GFP-DC組和普通未轉染DC組,熒光倒置顯微鏡觀察DC的形態(tài)學變化,培養(yǎng)48h后WesternBlotting法鑒定PSMA與4-1BBL基因在DC中的表達,直接免疫熒光法檢測未感染DC與腺病毒感染后DC上CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達,ELISA試劑盒測定各組DC疫苗

5、培養(yǎng)上清中IL-12分泌量的變化?；旌狭馨图毎磻獪y定不同組DC疫苗對T細胞增殖的影響,另外可確定DC與T細胞共培養(yǎng)的最佳細胞比例。ELISA試劑盒測定不同DC-CTL組培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10的分泌量。CCK-8法檢測不同轉染組DC-CTL細胞及CTL細胞分別對三種前列腺癌細胞(LNCap、Du145、22RV)的殺傷活性。
　　 結果
　　 1、經酶切電泳、測序、PCR法鑒定,證實重組腺病毒載體(pAdxsi

6、-GFP-PSMA和pAdxsi-GFP-4-1BBL)構建正確,插入片段包含PSMA和4-1BBL基因序列,Ad-PSMA滴度為2×10pfu/ml,Ad-4-1BBL滴度為1.2×10pfu/ml。
　　 2、同一MOI下轉染48h后轉染效率最高,另確定最佳MOI為200。
　　 3、PSMA和4-IBBL蛋白可以在DC上正常表達,腺病毒感染后不會影響DC的成熟及形態(tài)學改變,共轉染組DC表面CD80、CD83、CD8

7、6、HLA-DR共刺激分子均上調,明顯高于其它DC組;上清液中IL-12分泌水平共轉染組(134.29±2.22)pg明顯高于單個轉染組及未轉染組(P＜0.05);DC:T同一比例下,共轉染組刺激自體T細胞增殖能力明顯高于其他轉染組及未轉染組(P＜0.05),各組DC疫苗與T細胞共培養(yǎng)時PSMA/4-1BBL-DC-CTL組IFN-γ分泌量最高,達1176.10±14.37pg/2×106cells,IL-10分泌量最低,為75.14±

8、2.01pg/2×106cells,與其他各組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);效靶比為40:1時腫瘤殺傷作用最強,在同一效靶比時PSMA/4-1BBL-DC-CTL對LNCap的殺傷率明顯高于對另兩種前列腺癌細胞DU145、22RV的殺傷率(P＜0.05),也明顯高于其它DC-CTL組的殺傷率(P＜0.05)。
　　 結論
　　 本實驗中成功構建了Ad-GFP-PSMA和Ad-GFP-4-1BBL病毒質粒,體外