重組腺病毒載體介導(dǎo)CD基因-5-FC系統(tǒng)治療前列腺癌的系列實驗研究.pdf

1、上海醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文重組腺病毒載體介導(dǎo)CD基因/5-FC系統(tǒng)治療前列腺癌的系列實驗研究姓名：張正望申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)泌尿外科指導(dǎo)教師：張永康2000.5.1^ 殿S 刪C T的重組腺病毒，為C D ／5 一F C 系統(tǒng)提供理想的載體，并為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。方法：遺過酶切、脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染和雜交篩選，獲褥重宴簌腺病毒栽體A d C M V C D 的陽性克隆，熏組腺病毒在2 9 3 輔助細(xì)胞中進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)增并通過C s c

2、I 梯度超速離心、透析進(jìn)行純化，最后用空斑試驗確定病毒液的滴度．蜻果：共獲得純化的離滴度霞組腺病毒液3 ．2 m i ，其滴度( t i t r e ) 為3 xi o np f u ／m l 。蛄論：純化高漉度重組艨病毒載體A d C M V C D 的制備，為開展腺縭毒介導(dǎo)C D 基因／5 - F C 系統(tǒng)治療前列朦癌的一系列后續(xù)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。纂- B e 、C l } I S - - F C 蓑綾對手體外翦劌蒜癌緞臆系9 t

3、 i - - 14 5 、階1 的生長抑制作用翻的：研究C D ／5 一F c 系統(tǒng)對于體外前列腺癌細(xì)胞系D U - 1 4 5 、R M - I 的生長拇剁作用，探討英在前列艨癌基因治療中鰓可行性。方法：重緞腺病毒載體A d C M V C D 介導(dǎo)c D 基因分別感染體外生長的前列腺癌細(xì)胞D U - 1 4 5 、R 給l ，用R T - P C R 技術(shù)檢測病毒感染細(xì)胞中c 蟄基霞磚表達(dá)，x —g a l 染色法測定腺病毒的轉(zhuǎn)基因

4、效率，同時對比重組腺病毒感染前麝細(xì)胞生長強線鼴變化，并瘸結(jié)晶紫分榜法( C r y s t a lv i o l e ta s s a y )觀察C D ／5 - F C 系統(tǒng)對于上述兩種體外前列腺癌細(xì)胞的生長抑制作用和旁觀者效應(yīng)。結(jié)果：含c D 基靄姆蜜組繇癍毒A d C M V C D 感染體外薷歹l j腺癌細(xì)胞D U - 1 4 5 、R 卅1 后，R T —P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物中有與p B l u e s c r i p t -

5、 C D鰱P C R 產(chǎn)物申棚同黲冀段，表嚷C 瑟基因已在受感染的細(xì)胞申獲得表達(dá)：通過X - g a l 染色，發(fā)現(xiàn)巋M O I 為1 0 0 時腺病毒的轉(zhuǎn)基因效率已接近1 0 0 ％；A d C M V C D 感染體玲生長盼囂列驟癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)孛、低瀛魔的病毒顆粒并不影響體外細(xì)胞的生長，雨高滴度的病毒顆粒則對體外細(xì)胞具有一定媳毒性镩照；C D ／5 - F C 系統(tǒng)磚子預(yù)后能銹顯糖鍘體夕} 裁列腺癌細(xì)胞D U l 4 5 ，R M

6、- 1 的生長， 9 6 - 1 4 4 小時基本i 覬到完套抑制，M 0 1 = 1 0 崤，英拇鍘事接適9 0 S ，M O I = 1 0 0 和1 0 0 0 時，則接近1 0 8 囂：幽已感染病毒的細(xì)胞與未感染的野生型細(xì)胞按照一定比例混合時，5 一K 不僅能按鍘A d C M V C D 受染細(xì)胞穗生長，而墓對其闊圖表受染的努斑型細(xì)胞也有殺傷作用，表明C D ／5 - F C 系統(tǒng)存在旁觀者效應(yīng)，當(dāng)受染細(xì)胞數(shù)：泰受染鰓胞數(shù)秀9