PSCA重組腺病毒轉染DC誘導CD8+CTL對前列腺癌體內體外殺瘤效果評價.pdf

1、前言:
　　前列腺癌是男性中最常見的上皮惡性腫瘤之一，患者早期無明顯特異性臨床癥狀，因此，確診時多數(shù)患者已發(fā)展至中晚期，患者錯過癌癥最佳治療時期，導致前列腺癌患者預后效果差、死亡率高。遺傳因素、過多性生活、不良飲食習慣等因素增加了前列腺癌發(fā)生的風險，使得前列腺癌具有較高的發(fā)病率。因此，前列腺癌的治療成為了廣大科研工作者的研究重點。
　　手術、化療和放療是癌癥治療的常見治療方式。手術治療作為癌癥治療的首選能夠完全移除腫瘤，然而

2、對晚期腫瘤和轉移性腫瘤的治療效果有限，同時對患者造成永久性創(chuàng)傷。化療作為全身治療手段能夠殺傷多種腫瘤細胞且取得了良好的癌癥治療效果。然而由于化療藥物缺乏特異性，常引起患者出現(xiàn)免疫功能低下、肝腎損傷、骨髓抑制等不良反應，限制了化療藥物癌癥治療的應用。放療在腫瘤治療中的地位和作用受到了廣泛的關注，然而放療受腫瘤病理分級、細胞分化程度、增殖速度、細胞含氧量等多種因素影響，降低了放療應用范圍。內分泌治療是中晚期前列腺癌治療的首選治療方案，但內分

3、泌治療難以完全殺滅腫瘤細胞，并且導致雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生以及性欲減退、肌力降低等多種副作用。因此，尋找新型方案成為了前列腺癌治療的關鍵。
　　腫瘤免疫治療是一種利用免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞的新型癌癥治療方式，具有副作用小、特異性強等優(yōu)點。其通過提高腫瘤細胞免疫原性以及免疫效應細胞的腫瘤殺傷敏感性達到有效殺傷腫瘤細胞的目的。樹突細胞(Dendritic cell，DC)作為專職抗原呈遞細胞，能夠有效攝取和加工處理抗原，然后通過主

4、要組織相容性復合物(Major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ呈遞抗原并激活初始T細胞，實現(xiàn)啟動、調控和維持免疫應答的作用。細胞毒T淋巴細胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)能夠根據(jù)呈遞的抗原而特異性識別腫瘤細胞，能夠通過Fas/FasL途徑促進促凋亡相關蛋白分泌，同時釋放穿孔素與顆粒酶達到溶解細胞的目的。因此，選擇合適抗原決定CTL的腫瘤識別能力和抗腫瘤功能。
　　前列腺干細

5、胞抗原(Prostate stem cell anti gen，PSCA)主要在前列腺上皮細胞表面表達，其通過葡萄糖磷脂酰肌醇共價錨定于細胞膜表面。PSCA在惡性腫瘤組織如前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中高表達，其表達程度與腫瘤組織病理分級、分化程度、播散程度等呈正相關，并且在正常人類組織組織如前列腺基底細胞表面中呈現(xiàn)低表達。由于PSCA是一種特異性膜表達抗原，而不是分泌型，與PSA、PAP等分泌型抗原相比具有獨一無二的優(yōu)勢在誘導免疫耐受方面，

6、所以PSCA不僅是前列腺癌等相關腫瘤診斷及預后判斷的重要生物學指標，同時也是腫瘤免疫治療的潛在的重要靶點。由于其特有的性質和明顯的優(yōu)勢使PSCA成為了腫瘤免疫治療的理想靶點。
　　來自自身細胞突變的前列腺癌細胞具有較弱的抗原性，同時其能夠分泌多種細胞因子而抑制DC的抗原攝取和呈遞能力，導致腫瘤患者免疫功能低下。因此，提高DC的抗原攝取和呈遞能力對提高機體腫瘤細胞殺傷能力具有重要意義。重組腺病毒是重要的分子生物學工具，能將外源基因轉

7、至細胞內且能夠促進蛋白分子持續(xù)表達而不損傷細胞，同時具有安全性好、轉染效率高、操作簡單等優(yōu)點。因此利用重組腺病毒能夠引起DC持續(xù)性表達PSCA，提高了DC抗原加工處理和呈遞能力。
　　本研究擬構建PSCA重組腺病毒表達載體，通過轉染人DC而提高其抗原呈遞能力以及激活初始T淋巴細胞能力，從而獲得抗原特異性CD8+ CTL。同時檢測了PSCA特異性CD8+CTL的前列腺癌細胞細胞殺傷效果，并進一步進行了動物模型實驗。
　　材料與

8、方法:
　　一、實驗材料
　　1、細胞株:
　　PC-3（人前列腺癌細胞）、LNcap（人前列腺癌細胞）和RWPE-1（人前列腺上皮細胞）購于ATCC。細胞培養(yǎng)及消化傳代按照ATCC細胞培養(yǎng)說明進行。
　　2、實驗動物
　　4-5周齡Balb/c-nu/nu雄性裸鼠購買于中國醫(yī)科大學實驗動物中心，裸鼠飼養(yǎng)及相關實驗嚴格按照動物福利法要求進行。
　　3、組織標本
　　外周血采集自成年健康男性志愿者

9、。
　　二、主要研究方法
　　1、PSCA重組腺病毒構建以及鑒定:擴增PSCA基因并通過Adxsi系統(tǒng)構建復制缺陷型重組腺病毒載體pAdxsi-PSCA，然后大量制備該載體。轉染HEK293細胞后進行PSCA重組腺病毒包裝以及擴增。通過CsCl密度梯度離心進行病毒純化，并采用TCID50法進行病毒滴度測定。通過PCR法對重組腺病毒PSCA基因進行鑒定。
　　2、采集健康男性志愿者外周血，收集單核細胞源性樹突細胞，體外誘

10、導培養(yǎng)后進行重組腺病毒轉染:通過密度梯度離心法收集加入淋巴細胞分離液的外周血中的單核細胞，貼壁細胞用于DC培養(yǎng)，非貼壁細胞用于T細胞培養(yǎng)。利用PSCA-GFP重組腺病毒進行DC轉染，同時通過流式細胞儀、共聚焦顯微鏡確定最佳MOI值和最佳感染時間。同時通過Western blot鑒定AdPSCA轉染DC的PSCA蛋白表達情況。
　　3、通過倒置相差顯微鏡觀察AdPSCA轉染對DC形態(tài)影響;利用流式細胞儀和共聚焦顯微鏡檢測重組腺病毒轉

11、染DC后細胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR表達情況，同時利用ELISA法檢測重組腺病毒轉染對DC表達白介素(IL)-1O和IL-12表達影響;通過遷移實驗檢測重組腺病毒轉染對DC遷移能力的影響。
　　4、AdPSCA-DC與初始T淋巴細胞共培養(yǎng)，利用CCK-8法確定AdPSCA-DC對自體及異體T淋巴細胞增殖能力的影響;經(jīng)過3輪刺激后，并利用免疫磁珠分選CD8+CTL，確定AdPSCA-DC誘導CD8+CTL產(chǎn)

12、生情況。
　　5、通過Western blot確定PC-3、LNcap和RWPE-1中PSCA表達情況;利用流式細胞儀測定AdPSCA-DC-CD8+CTL對PC-3細胞最佳殺傷比例;利用流式細胞儀測定DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL分別對PC-3、LNcap和RWPE-1殺傷效果。
　　6、通過酶聯(lián)免疫斑點實驗測定在PC-3、LNcap和RWPE-1存在條件下，D

13、C-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL表達干擾素(IFN)-γ表達情況。
　　7、檢測DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制腫瘤形成情況。
　　8、Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部皮下注射PC-3細胞，構建前列腺癌荷瘤裸鼠模型。
　　9、檢測DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPS

14、CA-DC-CD8+CTL對荷瘤裸鼠的腫瘤殺傷情況、體重影響以及存活時間影響。
　　10、利用蘇木精-伊紅(HE)染色檢測各組CD8+CTL處理后腫瘤組織病理學改變情況以及利用免疫組織化學染色檢測各組CD8+CTL處理后腫瘤組織中VEGF、Bax和Bcl-2表達情況。
　　11、統(tǒng)計學分析:上述實驗重復至少3次。采用SPSS17.0對文中數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，結果采用均數(shù)±標準差（(x)±s）形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用SNK-q

15、檢驗， P＜0.05代表比較有顯著差異。
　　結果:
　　1、通過酶切、瓊脂糖電泳、測序和PCR鑒定，證實成功構建PSCA重組腺病毒載體，病毒滴度達到2.5×1011pfu/ ml;通過流式細胞儀和共聚焦顯微鏡確定最佳轉染MOI為200，最佳感染時間為48h。
　　2、通過Western blot證實AdPSCA轉染DC后，DC表達PSCA蛋白。
　　3、PSCA重組腺病毒轉染誘導DC出現(xiàn)典型形態(tài)學變化;同時DC

16、細胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR陽性細胞率升高;AdPSCA提高了IL-12表達量同時抑制了IL-10表達;同時AdPSCA提高了DC遷移能力。
　　4、AdPSCA-DC提高了T細胞增殖能力，同時能夠大量誘導CD8+CTL產(chǎn)生。
　　5、Western blot發(fā)現(xiàn)前列腺癌細胞PC-3高表達PSCA蛋白，前列腺癌細胞LNcap較高表達PSCA蛋白，前列腺上皮細胞RWPE-1低表達PSCA蛋白。

17、　　6、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)AdPSCA-DC-CD8+CTL最佳PC-3腫瘤細胞殺傷比例為40∶1。AdPSCA-DC-CD8+CTL對RWPE-1、LNcap和PC-3的殺傷比例達到8.87％±3.12、30.19％±4.13和52.60％±5.78，依次是Adnull-DC-CD8+CTL的1.31倍、4.54倍和7.37倍，同時是DC-CD8+CTL的1.81倍、5.81倍和10.31倍。

18、　　7、酶聯(lián)免疫斑點實驗表明:PC-3細胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL高表達IFN-γ，LNcap細胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL較高表達IFN-γ，RWPE-1細胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL弱表達IFN-γ;相關細胞刺激后，Adnull-DC-CD8+CTL和DC-CD8+CTL弱表達IFN-γ。
　　8、AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制PC-3細胞在Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部形成

19、腫瘤。
　　9、經(jīng)AdPSCA-DC-CD8+CTL處理后，荷瘤裸鼠腫瘤體積比（4.89±2.26）明顯低于PBS(27.43±2.76)、DC-CD8+CTL(25.74±2.10)和Adnull-DC-CD8+CTL(24.81±2.41)處理組，同時平均存活時間(37d)顯著長于PBS(22d)、DC-CD8+CTL(22d)和Adnull-DC-CD8+CTL(22d)處理組;經(jīng)過治療后4組荷瘤裸鼠體重未見明顯降低。

20、>　　10、AdPSCA-DC-CD8+CTL處理后，HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤組織出現(xiàn)明顯病理學改變，免疫組織化學染色表明腫瘤組織中VEGF和Bcl-2表達量明顯下調而Bax表達量明顯升高。
　　結論:
　　1、本研究成功構建PSCA重組腺病毒載體。
　　2、PSCA重組腺病毒載體轉染促進了DC表型及免疫功能成熟，獲得PSCA陽性DC。
　　3、AdPSCA-DC促進了T淋巴細胞增殖和CD8+CTL產(chǎn)生。
　　4、