負(fù)載PSA的rAAV轉(zhuǎn)染DC激活免疫效應(yīng)細(xì)胞治療前列腺癌的研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文負(fù)載PSA的rAAV轉(zhuǎn)染DC激活免疫效應(yīng)細(xì)胞治療前列腺癌的研究姓名：吳自勍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：羅榮城20070512中文摘要單個(gè)核細(xì)胞(DC前體細(xì)胞)，培養(yǎng)于6孔板，貼壁5h，輕輕洗去懸浮細(xì)胞(T細(xì)胞，AIMV另瓶培養(yǎng))。取貼壁細(xì)胞，以?xún)煞N方式刺激DC前體細(xì)胞，包括rAAV／PSA(第0天刺激)和LNCaP細(xì)胞凍融裂解物(第五天刺激)，前者感染后5h更換為新鮮AIM—V培養(yǎng)基，各組細(xì)胞均采用G

2、MCSF、IL一4誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞成熟。第七天，取原先另瓶培養(yǎng)的T細(xì)胞與培養(yǎng)所得DC按DC：T為1：20比例混合，以AIM—V為培養(yǎng)基，同時(shí)加入GMCSF、IL一2及IL7，共育5—7天，誘導(dǎo)獲得CTL。12DC和CTL表面標(biāo)志檢測(cè)及釋放因子檢測(cè)DC培養(yǎng)第7天，收集懸浮細(xì)胞(成熟DC)，流式細(xì)胞儀分析DC表面標(biāo)志，在培養(yǎng)第14天，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析CTL群體中CD8／CD4和CD8／CD56的比值情況。同時(shí)檢測(cè)DC分泌IL12及CTL分

3、泌IFNY情況。13CTL殺傷LNcaP細(xì)胞作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP細(xì)胞作靶細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色測(cè)定細(xì)胞活力，調(diào)細(xì)胞濃度1x105／ml，加入96孔板中，100u訝L，作為靶細(xì)胞；用F12液調(diào)整上述不同方式誘導(dǎo)成熟的效應(yīng)T細(xì)胞濃度為5x106／ml，按照效靶比為5：1、10：1、20：1、40：I的比例設(shè)置實(shí)驗(yàn)組混合CTL細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞，每比例3復(fù)孔，余3孔不與效應(yīng)細(xì)胞混合；效應(yīng)細(xì)胞按以上效靶比的數(shù)量加入96孔板，每種濃度3復(fù)孔。繼續(xù)培

4、養(yǎng)12dx時(shí)，加入每孔加入濃度為5mg／ml的MTTl0Ijtl，繼續(xù)培養(yǎng)6h，加入100“l(fā)鹽酸化異丙醇／孔。靜置5min后在酶標(biāo)儀上選取570nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔吸光度值(A值)，殺傷率％=[】(實(shí)驗(yàn)組A一效應(yīng)細(xì)胞A均值)／靶細(xì)胞A均值]x100％。另外對(duì)比進(jìn)行針對(duì)DUl45殺傷試驗(yàn)。2研究結(jié)果r兒w／PsA成功轉(zhuǎn)染了DC前體細(xì)胞(單核細(xì)胞)，DC培養(yǎng)良好，rAAV／PSA轉(zhuǎn)染的DC表面標(biāo)志CD80、CD86、PsA明顯高表達(dá)，分泌IL