負載PSA的rAAV轉(zhuǎn)染DC激活免疫效應(yīng)細胞治療前列腺癌的研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學博士學位論文負載PSA的rAAV轉(zhuǎn)染DC激活免疫效應(yīng)細胞治療前列腺癌的研究姓名：吳自勍申請學位級別：博士專業(yè)：腫瘤學指導教師：羅榮城20070512中文摘要單個核細胞(DC前體細胞)，培養(yǎng)于6孔板，貼壁5h，輕輕洗去懸浮細胞(T細胞，AIMV另瓶培養(yǎng))。取貼壁細胞，以兩種方式刺激DC前體細胞，包括rAAV／PSA(第0天刺激)和LNCaP細胞凍融裂解物(第五天刺激)，前者感染后5h更換為新鮮AIM—V培養(yǎng)基，各組細胞均采用G

2、MCSF、IL一4誘導DC前體細胞成熟。第七天，取原先另瓶培養(yǎng)的T細胞與培養(yǎng)所得DC按DC：T為1：20比例混合，以AIM—V為培養(yǎng)基，同時加入GMCSF、IL一2及IL7，共育5—7天，誘導獲得CTL。12DC和CTL表面標志檢測及釋放因子檢測DC培養(yǎng)第7天，收集懸浮細胞(成熟DC)，流式細胞儀分析DC表面標志，在培養(yǎng)第14天，通過流式細胞儀分析CTL群體中CD8／CD4和CD8／CD56的比值情況。同時檢測DC分泌IL12及CTL分

3、泌IFNY情況。13CTL殺傷LNcaP細胞作用取對數(shù)生長期的LNCaP細胞作靶細胞，臺盼蘭染色測定細胞活力，調(diào)細胞濃度1x105／ml，加入96孔板中，100u訝L，作為靶細胞；用F12液調(diào)整上述不同方式誘導成熟的效應(yīng)T細胞濃度為5x106／ml，按照效靶比為5：1、10：1、20：1、40：I的比例設(shè)置實驗組混合CTL細胞與腫瘤細胞，每比例3復孔，余3孔不與效應(yīng)細胞混合；效應(yīng)細胞按以上效靶比的數(shù)量加入96孔板，每種濃度3復孔。繼續(xù)培

4、養(yǎng)12dx時，加入每孔加入濃度為5mg／ml的MTTl0Ijtl，繼續(xù)培養(yǎng)6h，加入100“l(fā)鹽酸化異丙醇／孔。靜置5min后在酶標儀上選取570nm波長測定每孔吸光度值(A值)，殺傷率％=[】(實驗組A一效應(yīng)細胞A均值)／靶細胞A均值]x100％。另外對比進行針對DUl45殺傷試驗。2研究結(jié)果r兒w／PsA成功轉(zhuǎn)染了DC前體細胞(單核細胞)，DC培養(yǎng)良好，rAAV／PSA轉(zhuǎn)染的DC表面標志CD80、CD86、PsA明顯高表達，分泌IL