IL-15基因聯(lián)合腫瘤抗原修飾樹突狀細(xì)胞抗前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．構(gòu)建攜帶mouseIL-15基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體（Ad-GFP-mIL-15）并大量制備。 2．建立從小鼠骨髓前體細(xì)胞中分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的方法：將Ad-GFP-mIL-15和RM-1小鼠前列腺癌細(xì)胞裂解產(chǎn)物上清（Lysate）共同修飾DC。構(gòu)建新型前列腺癌DC疫苗（IL-15/lysate-DC），評價(jià)其免疫生物學(xué)特性。 3．通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)

2、IL-15/lysate-DC疫苗抗前列腺癌免疫治療作用，為以DC為基礎(chǔ)的前列腺癌免疫治療和基因轉(zhuǎn)染治療提供新的策略。 方法： 1．以小鼠腎臟cDNA為模板，用pfx DNA ploymerase擴(kuò)增mIL-15目的基因，擴(kuò)增得到的目的基因片段克隆到pGEM-T Easy Vector上，得到mIL-15-T克隆載體；從mIL-15-T克隆載體上EcoRⅠ雙酶切得到mIL-15基因，連接到pShuttle-GFP-CMV

3、載體上，得到pShuttle-GFP-mIL-15；將pShuttle-GFP-mIL-15轉(zhuǎn)移到pAdxsi載體上，得到Ad-GFP-mIL-15病毒質(zhì)粒，并完成了腺病毒的大量擴(kuò)增和純化。 2．從小鼠骨髓分離DC前體細(xì)胞，在細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4聯(lián)合作用下，大量制備骨髓源性DC（bone marrow derived DC，BM-DC）。采用形態(tài)學(xué)（光鏡）、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫生物學(xué)等方法研究DC的免疫生物學(xué)特性。將Ad

4、-GFP-mIL-15病毒轉(zhuǎn)染聯(lián)合RM-1小鼠前列腺癌細(xì)胞的裂解產(chǎn)物上清（Lysate）共同修飾DC，制備IL-15/lysate-DC前列腺癌疫苗。 3．體外實(shí)驗(yàn)檢測IL-15/lysate-DC刺激同基因型T細(xì)胞增殖能力、刺激T淋巴細(xì)胞亞群表型分析，刺激同基因型小鼠T細(xì)胞增殖反應(yīng)中淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-10水平，誘導(dǎo)CTL能力及殺傷活性。 4．建立RM-1前列腺癌細(xì)胞荷瘤小鼠動(dòng)物模型，觀察IL-15/ly

5、sate-DC疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療作用，并分析其可能的作用機(jī)制；ELISA方法檢測荷瘤小鼠治療后血清中IFN-γ和IL-10表達(dá)水平。 結(jié)果： 1．所構(gòu)建的Ad-GFP-mIL-15病毒質(zhì)粒，經(jīng)酶切電泳、測序及RT-PCR鑒定，證實(shí)重組腺病毒載體構(gòu)建正確，插入片段包含mIL-15基因序列。 2．在細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)下，體外培養(yǎng)5天后，可從每只小鼠骨髓DC前體細(xì)胞中獲得5～10×106個(gè)DC。早

6、期未成熟DC表達(dá)很低的表面共刺激分子、黏附分子和MHC分子，刺激T細(xì)胞增殖能力極弱；5天的DC在轉(zhuǎn)染Ad-GFP-mIL-1548小時(shí)后，表面共刺激分子、黏附分子和MHC分子明顯上調(diào)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR）強(qiáng)烈；將Ad-GFP-mIL-15聯(lián)合RM-1小鼠前列腺癌細(xì)胞的裂解產(chǎn)物上清（Lysate）共同修飾DC，制備IL-15/lysate-DC前列腺癌疫苗，流式細(xì)胞儀（flow

7、cytometry，F(xiàn)CM）檢測其表面共刺激分子、黏附分子和MHC分子明顯上調(diào)。 3．IL-15/lysate-DC前列腺癌疫苗刺激同基因型小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯升高；刺激同基因型小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群表型分析，證實(shí)IL-15/lysate-DC可使T淋巴細(xì)胞中CD8+T亞群比例細(xì)胞明顯升高；刺激同基因型小鼠T細(xì)胞增殖反應(yīng)中淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-10的檢測，證實(shí)IL-15/lysate-DC組淋巴細(xì)胞上清中I

8、FN-γ水平明顯增高，IL-10水平最低；在誘導(dǎo)CTL能力及殺傷活性檢測實(shí)驗(yàn)中，四氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）還原法顯示IL-15/lysate-DC組對RM-1前列腺癌細(xì)胞的特異性細(xì)胞殺傷率最高；上述實(shí)驗(yàn)中，IL-15/lysate-DC組與GFP/lysate-DC組、Lysate-DC組相比，差異有顯著性意義（P<0．05）。 4．RM-1細(xì)胞前列腺癌荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功，成瘤

9、率100％。IL-15/lysate-DC治療組荷瘤生長減緩，生存期延長。接種RM-1前列腺癌細(xì)胞10周后，IL-15/lysate-DC組仍有50％的小鼠存活，上述實(shí)驗(yàn)中，IL-15/lysate-DC組與GFP/lysate-DC組、Lysate-DC組、PBS組相比，差異有顯著性意義（P<0．05）。 5．ELISA檢測顯示，荷瘤小鼠經(jīng)免疫治療2次后，IL-15/lysate-DC組血清IFN-γ水平明顯增高，IL-10水

10、平最低，與GFP/lysate-DC組、Lysate-DC組、PBS組相比，差異有顯著性意義（P<0．05）；組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，IL-15/lysate-DC治療組的荷瘤鼠，瘤體內(nèi)、瘤周有大量炎性細(xì)胞（淋巴、單核細(xì)胞）浸潤，腫瘤組織局部壞死明顯。GFP/lysate-DC組、Lysate-DC組也可見瘤體內(nèi)部分組織壞死及炎性細(xì)胞浸潤，但明顯少于IL-15/lysate-DC組，PBS組幾乎無腫瘤壞死及炎性細(xì)胞浸潤。 結(jié)論：

11、 1．成功構(gòu)建了Ad-GFP-mIL-15病毒質(zhì)粒。 2．在細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)下，可從小鼠骨髓前體細(xì)胞中獲得足夠數(shù)量DC；轉(zhuǎn)染Ad-GFP-mIL-15能促進(jìn)DC成熟、上調(diào)MHC-Ⅱ類分子、表面共刺激分子和黏附分子的表達(dá)，MLR檢測示刺激T細(xì)胞增殖能力明顯提高。 3．IL-15/lysate-DC疫苗能激發(fā)同基因型T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)IFN-γ因子分泌能力強(qiáng)，使T淋巴細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞亞群比例明顯升高；