抗前列腺癌單鏈抗體介導的靶向siRNA抑制Notch1基因抗腫瘤實驗研究.pdf

1、前列腺癌是男性發(fā)病率第二位的惡性腫瘤,我國前列腺癌發(fā)病率也逐年升高,其發(fā)病增長率已居泌尿生殖系腫瘤之首。前列腺癌具有潛伏性長、發(fā)病率高的特點。在我國70歲以上男性人群中,高達25％的人患有前列腺癌。但臨床上前列腺癌早期診斷率低,因而多數患者失去了早期手術根治的機會。
　　通過siRNA下調Notch1基因可以有效抑制人類前列腺癌細胞的生長。然而如何靶向輸送siRNA進入特定細胞是臨床應用此技術的主要障礙。最近有研究表明,單鏈抗體介

2、導的靶向輸送系統(tǒng)是高效下調相應基因的有效方法。為了解決RNA干擾技術在體內應用缺乏靶向性的難題,我們擬通過抗前列腺癌單鏈抗體的融合基因,并予以優(yōu)化,進行表達、純化后獲得融合蛋白scFv-Fdt-HA2-tp(sFH-tP),構建成siRNA靶向輸送系統(tǒng)。利用FITC-siRNA在體內外驗證這一系統(tǒng)的有效性;隨后驗證靶向輸送的針對Notch1基因抑制效果最佳的siRNA在體內外對前列腺癌細胞生長的抑制作用。利用這一靶向輸送系統(tǒng)不但能克服s

3、iRNA在體內輸送效率低下,還避免siRNA大量應用時所產生的“脫靶”效應、非特異性免疫反應等問題,實現(xiàn)對腫瘤生長的高效抑制,為RNA干擾技術在前列腺癌的臨床治療中的應用提供理論、實驗依據。目前前列腺特異性膜抗原(PSMA)被認為是一個較明確的前列腺抗原。
　　我們的前期研究工作表明Notch信號通路中的Notch1在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,應用siRNA抑制前列腺癌細胞內Notch1基因的表達,引起細胞周期阻滯、細胞

4、凋亡,表明腫瘤細胞的生長受到有效的抑制,因此通過siRNA抑制Notch1基因有望成為一種有效的針對前列腺癌的基因治療方法。但由于缺乏有效的靶向給藥輸送系統(tǒng),常常出現(xiàn)藥物的“脫靶”現(xiàn)象,限制了此技術的進一步應用。本課題是在獲得高親和力的特異性抗前列腺癌單鏈抗體(scFv)的基礎上,擬將其與不同的基因片段融合并予以優(yōu)化,構建成融合蛋白。使單鏈抗體介導的靶向輸送系統(tǒng)與特異性的siRNA結合后,在抗體的介導下到達靶細胞,隨抗體內化入細胞到達靶

5、點,從而高效抑制Notch1基因的表達。利用抗體介導siRNA可以特異性的到達腫瘤部位,從而實現(xiàn)特異、高效的抗腫瘤作用,同時避免siRNA大量應用時所產生的“脫靶”效應,此策略將為RNAi技術在腫瘤研究、治療中的應用開辟新途徑。
　　本研究的目的是評估單鏈抗體及兩種融合蛋白是否可以有效的將特異性siRNA輸送到PSMA陽性的前列腺癌細胞內。融合蛋白由抗PSMA單鏈抗體(scFv)、魚精蛋白截短體(tp)構成。將弗林蛋白酶(Furi

6、n)、流感病毒的融合肽(HA2)片段序列插入到單鏈抗體及魚精蛋白截短體之間構成另一融合蛋白。我們的結果表明,siRNA能夠被融合蛋白特異性的輸送到PSMA陽性的前列腺癌細胞內,sFH-tP融合蛋白效果更明顯。應用前列腺癌細胞系及前列腺癌荷瘤裸鼠模型,驗證靶向輸送系統(tǒng)引導下siRNA是否能夠在體內實現(xiàn)對Notch1的高效抑制,實現(xiàn)抗腫瘤效果。進一步的研究證實了siNotch1融合蛋白可以在體內及體外有效地抑制前列腺癌細胞的增殖。本研究成果