Probasin啟動子介導的靶向凋亡對前列腺癌的殺傷作用.pdf

1、前列腺癌在老年男性生殖系統(tǒng)常見。在國外,前列腺癌的發(fā)病率與死亡率僅次于肺癌，居第二位。在國內(nèi),隨著壽命的延長和生活方式的改變，其發(fā)病率也在增長，已成為嚴重威脅男性健康和生命安全的主要疾病。早期發(fā)現(xiàn)并且身體條件允許的患者可以實行手術(shù)治療；但是大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時都已經(jīng)是晚期，對這些病人目前沒有很好的治療方案，患者的平均生存率只有大約3年。因此，尋找新的前列腺癌治療方法顯得尤為迫切。 基因治療由于能對致病基因進行修復，替代和刪除從而發(fā)揮

2、治療作用而成為近年來的研究熱點。利用前列腺特異性的啟動子來表達外源基因，從而達到根治或控制前列腺癌的目的，這是令人矚目的一個研究方向。Probasin是一種自大鼠背外側(cè)葉前列腺的細胞核中分離出的蛋白質(zhì)，氨基酸序列分析表明它屬于lipocalin超家族(一種配體轉(zhuǎn)運蛋白)，免疫組織化學研究表明這種蛋白質(zhì)位于前列腺上皮細胞內(nèi)和前列腺分泌液中,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)probasin蛋白質(zhì)的表達受雄激素的調(diào)控并且具有前列腺組織特異性。所以probasin啟

3、動子繼前列腺特異抗原(PSA)啟動子之后成為又一個受到關(guān)注的對象。Caspase的活化是不同細胞凋亡途徑中共同的下游事件。Caspase-3是最主要的效應(yīng)caspase之一，它在細胞中以酶原形式存在，一級結(jié)構(gòu)中自N端起依次為原結(jié)構(gòu)域(prodormain)、大亞基和小亞基。細胞發(fā)生凋亡時，caspase-3被上游caspase切割，原結(jié)構(gòu)域被去除，大、小亞基之間發(fā)生斷裂，并重新組裝成具有活性的caspase-3分子?；罨痗aspase-

4、3可以作用于細胞內(nèi)多種結(jié)構(gòu)和功能蛋白，引起細胞凋亡。 本實驗首先利用PCR的方法從大鼠前列腺組織中克隆出(-426～+28bp)的probasin啟動子序列，經(jīng)測序正確后利用交疊PCR技術(shù)克隆出含有2個雄激素反應(yīng)元件的ARR2PB啟動子序列，把兩個正確的啟動子序列插入到pPRIME表達載體以及熒光素酶載體pGL3-Basic，構(gòu)建由PB和ARR2PB啟動子調(diào)控的表達GFP的pPRIME載體和熒光素酶載體，并把PGL3載體上的熒光

5、素酶基因切下插入到CMV啟動子調(diào)控的pcDNA3.1 His A 載體中作為對照，把以上載體轉(zhuǎn)染入不同的前列腺癌、非前列腺癌細胞系及正常細胞系中驗證啟動子的活性和特異性，并用pEGFP-N2 載體作為瞬時轉(zhuǎn)染率的對照。GFP綠色熒光觀察結(jié)果顯示兩種啟動子具有前列腺的組織特異性，在LNCaP中熒光最強，其中ARR2PB啟動子的活性明顯高于PB啟動子。流式細胞術(shù)檢測熒光表達量以及熒光素酶的檢測結(jié)果都證實了所看到的熒光結(jié)果，即probasin

6、啟動子具有前列腺的組織特異性，其中啟動子的活性依次是CMV>ARR2PB>PB。 接著把構(gòu)建的PB-pPRIME和ARR2PB-pPRIME表達載體上的GFP序列替換成caspase-3序列，構(gòu)建了由PB和ARR2PB 調(diào)控的PB-pPRIME-caspase-3,ARR2PB-pPRIME-caspase-3,以及未替換CMV啟動子的pPRIME-caspase-3對照載體，把以上載體轉(zhuǎn)染入激素依賴的前列腺癌細胞LNCaP和激

7、素非依賴PC3細胞，用間接免疫熒光染色檢測caspase-3基因在細胞中的表達，流式細胞術(shù)，Hoechst33258染色，電鏡觀察等方法檢測促凋亡作用。間接免疫熒光染色結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染以上載體后前列腺癌細胞中有caspase-3陽性細胞的出現(xiàn)，與正常未轉(zhuǎn)染構(gòu)建載體的對照細胞相比陽性細胞數(shù)目明顯增加。 Hoechst33258染色，電鏡等方法顯示兩種不同形式的啟動子都能介導caspase-3 的促凋亡作用，其中在轉(zhuǎn)染了pPRIME-

8、caspase-3 ，PB-pPRIME-caspase-3 以及ARR2PB-pPRIME-caspase-3 后流式細胞術(shù)顯示LNCaP的凋亡率分別是10.55﹪，7.74﹪和10.5﹪，而在PC3中的凋亡率分別為71.71﹪，57.56﹪和61.82﹪。與pPRIME質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，pPRIME-caspase-3，PB-pPRIME-caspase-3和ARR2PB-pPRIME-caspase-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率明顯