前列腺特異性膜抗原啟動子-增強子靶向調控UPRT-5-FU自殺基因系統(tǒng)對前列腺癌作用的實驗研究.pdf

1、目的 本研究通過構建前列腺特異性膜抗原(PSMA)啟動子/增強子靶向性調控的尿嘧啶磷酸核糖轉移酶(UPRT)基因真核表達重組質粒(pPSMApromoter/enhancer-UPRT)，探索pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU自殺基因系統(tǒng)對前列腺癌特異的靶向殺傷作用。 方法①首先采用PCR技術，從前列腺癌細胞株LNCaP的總DNA中擴增PSMA啟動子和增強子基因序列，分子克隆技術將PSMA啟動子增強

2、子基因序列定向插入報告基因表達質粒載體(pEGFP-1)，構建重組質粒pPSMApromoter/enhancer-EGFP。應用PCR技術從大腸桿菌JM109基因組中擴增UPRT基因序列，同樣通過分子克隆技術將pPSMApromoter/enhancer-EGFP酶切去除EGFP，連接上UPRT基因，構建PSMA啟動子增強子靶向性調控的UPRT基因真核表達質粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT。②免疫組化技術檢測P

3、SMA在前列腺癌細胞株和非前列腺癌細胞株等不同細胞株的表達。脂質體介導轉染重組質粒pPSMApromoter/enhancerEGFP進入前列腺癌細胞株和非前列腺癌細胞株等，通過熒光表達來觀察PSMApromoter/enhancer在細胞中靶向調控作用。轉染重組質粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT和pPSMApromoter/enhancer-EGFP的LNCaP細胞株，加入G418，篩選出穩(wěn)定表達UPRT基因和

4、EGFP的細胞株。③MTT法檢測重組質粒轉染腫瘤細胞后，pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系統(tǒng)對細胞的生存率變化；FCM檢測pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系統(tǒng)對細胞增殖周期的改變，并進行細胞凋亡和壞死的測定；5-FU在UPRT催化下直接合成FdUMP和FUTP(F-RNA)，利用HPLC測定細胞外5-FU的含量變化，證明UPRT的功能。④不同比例的轉染細胞和非轉染細

5、胞混合培養(yǎng)，觀察pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系統(tǒng)對腫瘤細胞殺傷的旁觀者效應。 結果①成功構建重組質粒前列腺特異性膜抗原啟動子/增強子靶向性調控的pPSMApromoter/enhancer-EGFP；成功構建前列腺特異性膜抗原啟動子/增強子靶向性調控的UPRT基因真核表達質粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT，通過測序鑒定，基因序列正確、無缺失和突變。②應用免疫組化技術

6、對多種細胞進行PSMA表達檢測，僅有前列腺癌雄激素依賴性細胞株LNCaP的PSMA表達陽性。同時，對這幾種細胞株轉染靶向性調控的pPSMApromoter/enhancer-EGFP，同樣僅有表達PSMA的LNCaP有熒光表達，說明PSMA啟動子/增強子對前列腺癌的靶向特異性。③體外表達MTT檢測UPRT/5-FU自殺基因系統(tǒng)對細胞存活率影響，直接用藥和轉染UPRT基因后加入藥物均使前列腺癌細胞株LNCaP存活率下降，后者下降要明顯，計

7、算IC50，單用5-FU組為UPRT/5-FU系統(tǒng)組的5.5倍。UPRT/5-FU自殺基因系統(tǒng)作用細胞的抑制殺傷效能增強。④FCM檢測UPRT/5-FU系統(tǒng)作用引起的細胞凋亡顯示：正常細胞組凋亡率為5％，5-FU組為26％～28％，UPRT/5-FU系統(tǒng)組為40％～52％，三組進行兩兩比較，p均＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。而且，隨著5-FU濃度的增加，細胞的凋亡率也增大。細胞增殖周期的檢測結果示，LNCaP細胞的G1期明顯升高，S期細

8、胞所占比例下降，推斷藥物5-FU是影響細胞G1向S期的轉變，來干擾DNA合成。⑤利用高效液相色譜(HPLC)測定UPRT/5-FU系統(tǒng)作用后細胞外5-FU濃度變化，測得加入藥物2h后，轉UPRT基因組5-FU濃度下降快于單用5-FU組，隨后各組逐漸下降。⑥轉染細胞和非轉染細胞按照不同比例混合，觀察UPRT/5-FU系統(tǒng)旁觀者效應(BE)，實驗結果該自殺基因系統(tǒng)并沒有明顯的旁觀者效應，隨著轉染比例的增多，細胞抑制率也逐漸增加，沒有出現(xiàn)明顯