含rPB-DR啟動子和TK基因的重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定及對前列腺癌細(xì)胞的作用.pdf

1、前言 多數(shù)前列腺癌患者在病程后期其癌細(xì)胞獲得雄激素非依賴性生長，這成為晚期前列腺癌難以控制的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中存在兩種類型癌細(xì)胞，一類是表達(dá)雄激素受體，其在內(nèi)分泌治療失敗的前列腺癌中仍起著重要作用，許多細(xì)胞通過敏化使AR的活性大幅度提高，而獲得雄激素非依賴性生長。另一類AR表達(dá)喪失。研究發(fā)現(xiàn)：AR表達(dá)喪失癌細(xì)胞的比例越高，前列腺癌預(yù)后越差。所以，如能找到同時針對兩類前列腺細(xì)胞的治療方法，將對治療雄激素非依賴

2、性前列腺癌具有重要的意義。 目前，有關(guān)前列腺癌基因治療的治療策略很多。因?yàn)槎鄶?shù)治療方法沒有較好的特異性，不能直接針對前列腺癌細(xì)胞，所以其臨床應(yīng)用有限。 目前發(fā)現(xiàn)有兩種前列腺特異性啟動子，即PSA及rPB，兩者均含有兩個雄激素反應(yīng)元件(androgen-responseelement，ARE)及一個雄激素反應(yīng)區(qū)。如應(yīng)用前列腺特異性啟動子，可使前列腺癌基因治療的病毒載體大量安全的復(fù)制擴(kuò)增，從而達(dá)到安全高效的治療目的。但PSA

3、及rPB只對AR表達(dá)陽性的前列腺癌細(xì)胞有用，在AR表達(dá)陰性的前列腺則無任何作用。我們已經(jīng)知道無論AR表達(dá)陽性及AR表達(dá)陰性前列腺癌細(xì)胞均有維甲酸受體，因此，我們應(yīng)用維甲酸反應(yīng)元件替代rPB內(nèi)的雄激素反應(yīng)元件，構(gòu)建出對雄激素依賴及雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞均有明顯作用的改良型rPB-DR啟動子，并將其與TK自殺基因相連接，以腺病毒作為載體研究其對前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用。 第一部分含rPB-DR啟動子和TK基因的重組腺病毒的構(gòu)建和鑒

4、定 目的：構(gòu)建含rPB-DR啟動子和TK自殺基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒并進(jìn)行鑒定，為前列腺癌基因治療的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用分子克隆技術(shù)，將rPB-DR啟動子連接至pBluescriptSK-TK上構(gòu)建出pBluescriptSK-rPB-DR-TK，再酶切出rPB-DR-TK目的片斷，并將其連接至穿梭質(zhì)粒pShuttle上。將構(gòu)建好的pShuttle-rPB-DR-TK經(jīng)PmeI酶切線性化后再以電穿孔法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)

5、細(xì)菌E.coliBJ5183-AdEasy-1內(nèi)進(jìn)行同源重組，抽提質(zhì)粒經(jīng)卡那抗性篩選及酶切鑒定正確的即為pAd-rPB-DR-TK，再經(jīng)PacI酶切回收后以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，包裝出完整腺病毒，然后大量擴(kuò)增測定滴度，并行PCR鑒定。 結(jié)果和討論：經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定證實(shí)成功構(gòu)建了包含rPB-DR啟動子和TK自殺基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒pAd-rPB-DR-TK，包裝、擴(kuò)增后測病毒滴度為1.1×108TCID50/

6、ml。成功構(gòu)建出包含rPB-DR啟動子和TK自殺基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒并鑒定正確，可用于下一步前列腺癌基因治療的研究中 第二部分ADV-rPB-DR-TK對前列腺癌細(xì)胞的作用 目的：研究腺病毒載體介導(dǎo)的單純皰疹胸苷激酶(HSV-TK)基因/GCV(丙氧鳥苷)自殺基因治療系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞的特異殺傷作用。 方法：利用攜帶HSV-TK基因(自殺基因)和rPB-DR啟動子的重組腺病毒ADV-rPB-DR-

7、TK，感染體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞，然后加入GCV和維甲酸治療，以MTT比色法和臺盼藍(lán)拒染色法來測定不同濃度、不同時間下HSV-TK/GCV自殺基因治療體系對前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用。 結(jié)果和討論：ADV-rPB-DR-TK在GCV和維甲酸的誘導(dǎo)治療下，對前列腺癌細(xì)胞PC-3具有特異殺傷作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)腺病毒載體可以成功的將rPB-DR-TK導(dǎo)入前列腺癌細(xì)胞，并利用HSV-TK/GCV體系對前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行特異的殺傷作用