含Survivin啟動(dòng)子重組腺病毒載體的基因治療聯(lián)合放化療對(duì)卵巢癌的作用.pdf

1、腫瘤基因治療通常是指把外源性基因利用不同的方法導(dǎo)入患者體內(nèi)，利用基因產(chǎn)物的功能殺死腫瘤細(xì)胞。在基因治療的研究中，基因?qū)胂到y(tǒng)是最關(guān)鍵的技術(shù)，因此高效的載體表達(dá)系統(tǒng)是提高基因治療效率的關(guān)鍵。腺病毒是基因治療中最常用的載體，具有可插入大片斷外源基因、可感染非分裂期細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、培養(yǎng)物中可獲高滴度的病毒產(chǎn)量以及不整合到宿主細(xì)胞基因組等優(yōu)點(diǎn)。盡管腺病毒具有很多優(yōu)點(diǎn)并廣泛應(yīng)用于基因治療，但是依然存在缺乏特異性、腫瘤細(xì)胞靶向性及感染效率低下的缺

2、陷。目前可以通過改造腺病毒提高效率，即在腺病毒的基因組內(nèi)加入針對(duì)個(gè)別腫瘤特征的腫瘤特異性啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄水平使外源基因選擇性地在腫瘤部位高表達(dá)，最大程度地提高基因治療的高效性和安全性。 Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，它在正常組織中不表達(dá)，而在各種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明survivin基因在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在卵巢正常組織及良性卵巢腫瘤組織中幾乎不表達(dá)，因此可以作為卵巢腫瘤特異性啟

3、動(dòng)子在腫瘤的基因治療中發(fā)揮作用。本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了含survivin啟動(dòng)子的新型腺病毒載體AdGL3BSurvivin及具有治療作用的條件復(fù)制腺病毒(溶瘤病毒)CRAd-Survivin-RGD4C，經(jīng)過包裝，產(chǎn)出病毒，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，觀察survivin基因作為卵巢癌特異性啟動(dòng)子及放化療誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的作用，并探討應(yīng)用具有治療作用的條件復(fù)制腺病毒CRAd-Survivin-RGD4C聯(lián)合常規(guī)化療在卵巢癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤模型中的殺瘤作

4、用。 一、放、化療對(duì)凋亡抑制基因survivin在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)影響應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)2Gy60CO照射及5μg/ml順鉑處理后三種卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3及HO-8910(化療耐藥株)和OV2008(化療敏感株)中survivinmRNA表達(dá)的變化，同時(shí)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，四甲基偶氮唑藍(lán)比色法檢測(cè)放化療對(duì)細(xì)胞株的體外生長(zhǎng)抑制作用，以此探討放、化療對(duì)凋亡抑制基因survivin在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)

5、影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療后三種細(xì)胞survivinmRNA均明顯升高(P＜0.05)，凋亡率及抑制率均無明顯變化。順鉑作用后SKOV-3，HO-8910兩株細(xì)胞survivinmRNA明顯升高，OV2008明顯下降(P＜0.01)，兩種細(xì)胞株SKOV-3，HO-8910的凋亡率及抑制率有所升高但不明顯(P＞0.05)而OV2008的凋亡率及抑制率明顯升高(P＜0.05)。三株細(xì)胞對(duì)放射治療均不敏感，SKOV-3，HO-8910對(duì)順鉑也不敏感，

6、OV2008對(duì)順鉑較敏感。提示Survivin基因的表達(dá)可能是卵巢癌的放、化療抵抗的原因。 二、含survivin啟動(dòng)子的腺病毒載體的構(gòu)建、包裝、產(chǎn)出病毒及鑒定我們與美國(guó)Alabama大學(xué)基因研究中心合作，構(gòu)建了survivin基因作為特異性啟動(dòng)子的腺病毒載體質(zhì)粒AdGL3BSurvivin，以及有治療作用的條件復(fù)制腺病毒CRAd-Survivin-RGD4C。在DH5α中擴(kuò)增質(zhì)粒，PacI酶切后鑒定，重組子AdGL3BSurv

7、ivin及CRAd-Survivin-RGD4C構(gòu)建成功。經(jīng)293A細(xì)胞包裝產(chǎn)出病毒，并在293A細(xì)胞中擴(kuò)增病毒，可以獲得滴度高于為5.0×109pfu/ml的重組腺病毒。為進(jìn)一步研究survivin啟動(dòng)子的功能打下基礎(chǔ)。 三、Survivin基因作為卵巢癌放、化療誘導(dǎo)型特異性啟動(dòng)子的初步研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因(survivin，bax，VEGF)的表達(dá)；并經(jīng)放射線照射或順鉑處理后，檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞

8、株中這些基因的表達(dá)變化；將含survivin啟動(dòng)子的腺病毒AdGL3BSurvivin轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株及卵巢癌原代細(xì)胞，放化療處理后，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)方法檢測(cè)survivin啟動(dòng)子的變化。結(jié)果顯示在上述候選基因中，只有survivin基因在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)，而且表達(dá)量較高。在低于半數(shù)致死量的順鉑或放射線作用后，survivin基因表達(dá)明顯升高。含survivin啟動(dòng)子的腺病毒載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株及卵巢癌原代細(xì)胞經(jīng)放、化療處理后，Lu

9、ciferase的活性明顯升高，提示放化療可以誘導(dǎo)survivin啟動(dòng)子的表達(dá)，survivin可以作為放化療誘導(dǎo)型特異性啟動(dòng)子在腫瘤的基因治療聯(lián)合放、化療中發(fā)揮起作用。 四、含Survivin啟動(dòng)子重組的溶瘤腺病毒聯(lián)合化療對(duì)卵巢癌株HO-8910體內(nèi)、外作用的實(shí)驗(yàn)研究 含Survivin啟動(dòng)子的條件復(fù)制腺病毒CRAd-Survivin-RGD4C轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株HO-8910后，聯(lián)合化療，檢測(cè)其細(xì)胞毒作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶瘤