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1、目的;腫瘤特異性啟動子Survivin調(diào)控shRNA真核表達(dá)載體腺病毒的構(gòu)建以及對HepG-2細(xì)胞中CD133基因表達(dá)的抑制作用。
方法;1、pEntry-SUR-GFP-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建;參考試劑盒說明書提取HepG-2細(xì)胞基因組DNA。根據(jù)GenBank(-222 to+39,GeneBank Accession NumberAY795969)提供的survivin啟動子基因序列及pEntry載體上的酶切位點(diǎn)設(shè)
2、sal1和NdeⅠ酶切位點(diǎn)(上下游引物序列)5-GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC-3,下游引物序列5-GGAATTCCATATGGAATTCC-3擴(kuò)增片段為270BP將survivin啟動子克隆到pEntry-EF1-GFP-shRNA上,以替換EF1啟動子,構(gòu)建pEntry-Surp-GFP-shRNA真核表達(dá)載體。
2、pEntry-Surp-GFP-shRNA轉(zhuǎn)染Hela.HepG-2293T細(xì)胞
3、株;RT-PCR檢測GFP證實(shí)GFP的表達(dá)由survivin驅(qū)動,反應(yīng)引物上序列為5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3,下游引物序列為5-TTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTG-3,長度200 bp,通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱,證實(shí)survivin在HepG-2。Hela細(xì)胞株中有熒光,而293T細(xì)胞株中沒有熒光,且HepG-2細(xì)胞株表達(dá)高于Hela細(xì)胞,說明survivin基因具有腫瘤特異性。
3、shRN
4、A CD133的設(shè)計(jì),合成以及Ad.surp-GFP-shRNA的構(gòu)建和包裝:根據(jù)GenBank中CD133的核苷酸序列,參考Ambion公司設(shè)計(jì)shRNA的設(shè)原則,(1)設(shè)計(jì)3條干擾序GCTCAGAACTTCATCACAAAC2377),AAGCCAGAAACTGTAATCTTAG(485), ATGAGATTAAGTCCATGGCAAC(972),(2)通過Blast檢索確定三個干擾片段與人類的其他基因不同源;shRNA的合成;將三
5、個干擾片段切成六個小的片段,送華大基因公司合成12條Oligo片段。紫外線分光光度計(jì)在260 nm波長下定量,(3)切除pEntry-Surp-GFP-shRNA中的shRNA;連接目的基因;通過T4連接酶的作用,將合成好的shRNA927,shRNA485,shRNA2377分別連接到pEntry-Surp-GFP載體上。將構(gòu)建好的pEntry-Surp-GFP-shRNA通過gateway試劑盒重組腺病毒質(zhì)粒Ad.Surp-GFP-
6、shRNA,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌,卡那霉素,LB平板,每個板挑選三個陽性克隆搖菌過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒,PacⅠ酶切鑒定重組pAd-Surp-shRNA構(gòu)建成功,提取質(zhì)粒測量質(zhì)粒濃度為A260/A280=1.8032;A260/A280=t.8230; A260/A280=1.7104如圖1.1所示,送公司測序,結(jié)果正確。PacⅠ酶切后鑒定,重組子酶切顯示兩條切割帶分子量大小與酶切大小符合。通過gateway重組陽性的 pAd.su
7、rp-GFP-shRNA972,pAd.surp-GFP-shRNA485,pAd.surp-GFP-shRNA2377質(zhì)粒在293A細(xì)胞中包裝Ad.Surp-GFP-shRNA,Ad.surp-GFP-shRNA轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞,8d收集細(xì)胞,離心,2 ml滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸,反復(fù)凍融,離心收集上清液,此為低滴度的病毒原液Ad.Surp-shRNA,取50%病毒原液反復(fù)感染293A,13000 rpm離心收集上清,通過流
8、式計(jì)算可得到高滴度腺病毒通過公式計(jì)算為7.01x10(^)10 TU/ml。
4、含Survivin啟動子重組的shRNA CD133基因重組的腺病毒對肝癌細(xì)胞株HepG-2體外作用的實(shí)驗(yàn)研究;含Survivin啟動子的條件復(fù)制腺病毒Ad.surp-GFP-shRNA972,2377,485轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG-2感染293T細(xì)胞作為對比,應(yīng)用RT—PCR和Western blot檢測CD133mRNA和蛋白的表達(dá);MTT法
9、和Transwell法檢測細(xì)胞體外增殖和侵襲能力,結(jié)果顯示,腺病毒972,2377,485能成功封閉CD133蛋白水平的表達(dá);972,2377組能成功敲低CD133 mRNA的表達(dá);MTT,Transwell檢測證實(shí),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長抑制和侵襲力都低于空白組,計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與空白組相比mRNA抑制率分別為(63.44±0.02)%,(56.98±0.03)%;972組,2377組,485組蛋白抑制率分別為(55.43±0.4)%,(48.65
10、±0.2)%,(34.67±0.4)%;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖和侵襲能力也受到顯著抑制;972組抑制率為(72.88±0.74)%,2377組抑制率為(59.9±0.87)%,485組抑制率為(30.18±0.95)%。
結(jié)果:腫瘤特異性啟動子Survivin調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的shRNA能顯著下調(diào)CD133基因的表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞株HepG-2的增值和減弱其侵襲力。
結(jié)論:腫瘤特異性啟動子survivin調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的sh
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