卵巢特異性啟動子OSP-2的克隆及其在順鉑化療中調(diào)控Survivin保護CHO細胞的研究.pdf

1、化療是目前腫瘤治療的主要方法之一，然而，化療藥物的細胞毒性在殺傷腫瘤細胞的同時還能對人體的正常組織也造成傷害，包括對女性生殖腺——卵巢的損傷。化療引起卵巢的損傷包括卵巢功能紊亂、卵巢功能過早衰退和生殖能力下降等。已有研究顯示化療對卵巢的損害主要通過促進卵巢細胞凋亡的機制。目前保存卵巢組織和功能的措施有藥物保護、胚胎冷凍保存、卵子冷凍保存、卵巢組織冷凍保存以及贈卵。但是，現(xiàn)有的研究表明這些技術(shù)的效果并不盡如人意。隨著基因治療在腫瘤治療上取

2、得的進展，我們也嘗試將基因治療運用于卵巢組織的化療保護。在本研究中我們首次探索通過調(diào)控凋亡抑制基因在卵巢細胞中特異性表達減輕化療對卵巢的損傷的可行性。 第一章卵巢特異性啟動子OSP—2的克隆與功能檢測 目的:通過分子克隆技術(shù)得到卵巢特異性啟動子，并通過功能檢測驗證其組織特異性；然后，通過對啟動子序列的分析，初步探討卵巢特異性表達基因的調(diào)控機制。 方法: 1、分別提取卵巢組織基因組DNA和總RNA(tota

3、lRNA)； 2、依據(jù)卵巢特異性轉(zhuǎn)錄單位(ovarianspecifictranscriptionunits，OSTUs)序列的分析，設(shè)計特異性引物，通過RT—PCR自卵巢RNA中擴增目的片段； 3、通過TA克隆對所獲得的片段進行篩選，從中得到卵巢特異性啟動子OSP—2； 4、通過雙酶切置OSP—2于質(zhì)粒pEGFP—C2中，取代原有CMV啟動子，使綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GF

4、P)基因位于啟動子OSP—2的調(diào)控之下；作為陽性對照，OSP-1合成后依同法構(gòu)建重組載體pOSP-1-GFP；然后將所得的兩個重組載體轉(zhuǎn)染各種卵巢來源和非卵巢來源細胞株，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達； 5、同樣引物自卵巢基因組DNA中擴增目的片段，并通過TA克隆進行篩選，選取其中兩個與OSP-1和OSP—2相似度最高的片段，Mutant-1和Mutant—2，通過雙酶切構(gòu)建重組載體pMutant-1-GFP、pMuatnt—2-

5、GFP，然后將重組載體轉(zhuǎn)染各種卵巢來源和非卵巢來源細胞株，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達； 6、利用TFSEARCH軟件對OSP-1、OSP—2、Mutant-1、Mutant—2進行序列分析，觀察啟動子內(nèi)是否存在卵巢特異性順式作用元件及其變異是否與功能有關(guān)。 結(jié)果: 1、通過RT—PCR自卵巢RNA中擴增得到507bp大小的片段，TA克隆單克隆化后得到卵巢特異性啟動子OSP—2； 2、重組載體pOSP-1

6、-GFP、pOSP—2-GFP轉(zhuǎn)染細胞后，在卵巢來源細胞株CHO、HO—8910、OVCAR—3均見GFP的表達，而在非卵巢來源細胞株BRL、NRK中未見GFP的表達； 3、通過PCR自卵巢DNA中擴增得到與OSP—2同樣大小的片段，TA克隆后獲得若干與OSP-1、OSP—2高度相似的序列，選擇兩個相似度最高的片段構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染細胞后，發(fā)現(xiàn)無論在卵巢來源還是非卵巢來源細胞均未見GFP的表達； 4、TFSEARCH軟件

7、分析顯示，啟動子序列內(nèi)包含若干與卵巢生理相關(guān)的特異性順式作用元件，如雌激素反應(yīng)元件ER；在OSP-1和OSP—2內(nèi)這些順式作用元件未見突變，而在Mutant-1和Mutnat—2及其它自DNA中提取的片段內(nèi)則見到大量發(fā)生在特異性順式作用元件內(nèi)和/或其鄰近部位的突變。 結(jié)論: 1、利用分子克隆技術(shù)從OSTUs這一EST(expressedsequencetag，表達序列標簽)中分離得到一個LRT(longterminalr

8、epeat，長末端重復序列)樣序列，功能分析表明該序列具有卵巢特異性啟動子功能，由于該序列與先前已知的OSP-1具有同源性，因此命名為OSP—2； 2、序列比較顯示OSP—2與克隆自大鼠基因組DNA的其它LRT樣序列可能來源于同一或相近的祖先，進化過程中不同的堿基突變導致了不同的結(jié)局：OSP—2的啟動子功能得以保存并獲得了卵巢特異性，其余序列則功能丟失，成為JUNKDNA； 3、對OSP—2、OSP-1以及JUNKDNA

9、中的兩個成員Mutnat-1、Mutant—2的分析表明OSP—2中存在一些特異性順式作用元件(如ER)，這些元件對維持OSP—2的卵巢特異性啟動子功能具有決定性意義，其內(nèi)和/或鄰近部位的突變將導致功能的缺失； 4、OSP—2的克隆為進一步通過酵母單雜交等技術(shù)釣取與之特異性結(jié)合的蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)奠定了基礎(chǔ)，也為深入研究卵巢特異性基因表達調(diào)控提供了線索；另一方面，由于OSP—2功能的卵巢特異性，OSP—2有可能成為卵巢基因治療和轉(zhuǎn)

10、基因動物模型的制備中又一得力工具。 第二章OSP—2調(diào)控Survivin在順鉑化療中保護CHO細胞的研究 目的：利用OSP—2驅(qū)動凋亡抑制基因survivin在CHO細胞特異性表達，在體外實驗中探索將基因治療手段運用于卵巢組織的化療保護的可行性。 方法: 1、通過酶連酶切反應(yīng)構(gòu)建重組載體pOSP—2-Survivin—GFP，使survivin—GFP融合蛋白直接位于卵巢特異性啟動子OSP—2的調(diào)控之下；

11、 2、重組載體pOSP—2-Survivin—GFP轉(zhuǎn)染CHO細胞，經(jīng)G418篩選后獲得單細胞克隆，經(jīng)GFP檢測和survivin免疫組化驗證，獲得穩(wěn)定表達survivin重組蛋白的CHO細胞克??； 3、分別給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞及未轉(zhuǎn)染CHO細胞常規(guī)治療劑量的順鉑化療，通過CCK8法及流式細胞技術(shù)檢測兩組細胞的生長曲線及細胞凋亡率。 結(jié)果: 1、經(jīng)G418篩選獲得若干單細胞克隆，挑取單克隆分別培養(yǎng)后行熒光顯微

12、鏡下GFP檢測和survivin免疫組化驗證，獲得了穩(wěn)定表達survivin重組蛋白的CHO細胞克??； 2、給予常規(guī)治療劑量的順鉑化療后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞的生長均呈下降趨勢，然而，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的下降趨勢明顯緩于未轉(zhuǎn)染細胞；在細胞凋亡的檢測中也發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的凋亡率的下降趨勢明顯緩于未轉(zhuǎn)染細胞。 結(jié)論: 1、OSP—2能夠驅(qū)動凋亡抑制基因survivin在卵巢來源細胞特異性表達； 2、首次成功將s