Ki67啟動(dòng)子調(diào)控荷載雙基因RNA干擾的條件增殖腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建Ki67啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)Ki67siRNA和hTERTsiRNA的條件增殖腺病毒。
　　 方法：1．合成兩端引入BamHI/HindⅢ酶切位點(diǎn)的hTERTsiRNA基因序列，退火使雙鏈配對(duì)，連接進(jìn)pSilencer3.1的BamHI/HindⅢ位點(diǎn)，構(gòu)建pShTERTsiRNA并測(cè)序。2．分別用Xba I/EcoRV酶切質(zhì)粒pZKi67、pZD55-Ki67siRNA，將上述酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，分別純化Ki67啟動(dòng)

2、子片段和Ki67iRNA片段，兩片段連接，構(gòu)建pZKi67-ZD55-Ki67siRNA。PCR、酶切鑒定。3．以pShTERTsiRNA為模板，設(shè)計(jì)hTERTsiRNA的特異性引物，PCR拉出hTERTsiRNA及H1啟動(dòng)子，電泳回收hTERTsiRNA片段，克隆進(jìn)pZKi67-ZD55-Ki67siRNA的XhoI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pZKi67-ZD55-Ki67siRNA-hTERTsiRNA。PCR、測(cè)序鑒定。4．用BglⅡ酶切質(zhì)粒

3、pZKi67-ZD55-Ki67siRNA-hTERTsiRNA、pZKi67-ZD55-Ki67siRNA，取酶切大片段進(jìn)行自連，構(gòu)建pZKi67-ZD55-Ki67siRNA、pZKi67-ZD55。PCR、測(cè)序鑒定。5．將pZKi67-ZD55-Ki67siRNA-hTERTsiRNA、 pZKi67-ZD55-hTERTsiRNA、pZKi67-ZD55-Ki67siRNA、pZKi67-ZD55分別與腺病毒包裝骨架質(zhì)粒pBHG

4、E3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，9-12天后出現(xiàn)病毒空斑。病毒小量擴(kuò)增后提取重組腺病毒的DNA，PCR鑒定正確者即為條件增殖腺病毒ZKi67-ZD55-Ki67siRNA-hTERTsiRNA、ZKi67-ZD55-hTERTsiRNA、ZKi67-ZD55-Ki67siRNA、ZKi67-ZD55。
　　 結(jié)果：1．PCR、測(cè)序鑒定表明pShTERTsiRNA構(gòu)建成功。2．PCR、酶切鑒定pZKi67-ZD55-Ki67siRNA構(gòu)建成

5、功。3．PCR、測(cè)序鑒定pZKi67-ZD55、pZKi67-ZD55-hTERTsiRNA、pZKi67-ZD55-Ki67siRNA-hTERTsiRNA構(gòu)建成功。4．PCR鑒定表明病毒ZKi67-ZD55-Ki67siRNA-hTERTsiRNA、ZKi67-ZD55-hTERTsiRNA、ZKi67-ZD55-Ki67siRNA、ZKi67-ZD55包含目的基因，且無野生型腺病毒污染。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建的ZKi67-