G250啟動子調(diào)控表達(dá)Ki67-siRNA的條件增殖型腺病毒靶向治療腎癌研究.pdf

1、目的:研究G250啟動子調(diào)控表達(dá)Ki67-siRNA的條件增殖型腺病毒G250-ZD55-Ki67體外靶向抑制腎癌細(xì)胞的療效,為體內(nèi)實驗及臨床應(yīng)用G250-ZD55-Ki67靶向治療腎癌奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.質(zhì)粒pZD55-Ki67、pG250-ZD55-Ki67、pG250-ZD55-EGFP、pBHGE3的大量制備及酶切鑒定。
　　 2.將鑒定正確的質(zhì)粒分別與含有腺病毒的右臂質(zhì)粒pBHGE3

2、共轉(zhuǎn)染低代293細(xì)胞,9-12d后出現(xiàn)病毒空斑。
　　 3.病毒小量擴增后提取重組腺病毒的DNA,PCR鑒定正確者即為所需的條件增殖型腺病毒。
　　 4.腺病毒鑒定正確后大規(guī)模轉(zhuǎn)染低代293細(xì)胞,大量擴增,純化,測定滴度。
　　 5.Western Blot法及免疫組化法檢測腺病毒E1A蛋白在腎癌786-0、ACHN細(xì)胞及HK-2細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 6.結(jié)晶紫染色法檢測腺病毒對腎癌786-0、ACH

3、N細(xì)胞及HK-2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　 7.RT-PCR法檢測腺病毒Ki67-siRNA對腎癌786-0、ACHN細(xì)胞的基因沉默效果。
　　 8.MTT法檢測腺病毒對腎癌786-0、ACHN細(xì)胞增殖的影響。
　　 9.Annexin V-PE/7-AAD法檢測腺病毒對腎癌786-0、ACHN細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.酶切鑒定左臂質(zhì)粒pZD55一Ki67、pG250-ZD55-Ki

4、67、pG250-ZD55-EGFP及右臂質(zhì)粒pBHGE3正確。
　　 2.PCR鑒定表明重組腺病毒G250-ZD55-Ki67、G250-ZD55-EGFP、ZD55-Ki67包含目的基因,且無野生型腺病毒污染。三種病毒的滴度分別為:2.3x1011 PFU/ml、2.11x1011PFU/ml、1.97×1011 PFU/ml。
　　 3.三種腺病毒的E1A蛋白在腎癌786-0細(xì)胞中均表達(dá):在正常腎小管HK-2細(xì)胞中

5、均不表達(dá);在腎癌ACHN細(xì)胞中只有腺病毒ZD55-Ki67表達(dá),其余兩種腺病毒均不表達(dá)。
　　 4.MOI=1的G250-ZD55-Ki67可以將腎癌786-0細(xì)胞部分殺滅,MOI=10時全部殺滅。MOI=10的ZD55-Ki67和G250-ZD55-EGFP只能將腎癌786-0細(xì)胞部分殺滅,MOI=100時全部殺滅。MOI=100的G250-ZD55-Ki67可以將腎癌ACHN細(xì)胞部分殺滅。MOI=10的ZD55-Ki67可以

6、將腎癌ACHN細(xì)胞部分殺滅,MOI-100時全部殺滅。MOI=100的G250-ZD55-EGFP對腎癌ACHN細(xì)胞無明顯殺傷作用。MOI=100時三種病毒對正常腎小管HK-2細(xì)胞均無殺傷作用。
　　 5.G250-ZD55-Ki67抑制腎癌細(xì)胞Ki67表達(dá)能力與ZD55-Ki67相似,且特異性比更ZD55-Ki67更高。
　　 6.G250-ZD55-Ki67、ZD55-Ki67、G250-ZD55-EGFP對腎癌78

7、6-0細(xì)胞增殖均有抑制作用,ZD55-Ki67對腎癌ACHN細(xì)胞增殖有抑制作用,并且存在濃度及時間依賴性,當(dāng)MOI=0.1時,抑制作用較弱,隨著濃度增高,抑制作用逐漸增強,MOI=100時抑制作用最強。隨著天數(shù)增加,抑制逐漸增強,第四天抑制作用最強。G250-ZD55-Ki67、G250-ZD55-EGFP對腎癌ACHN細(xì)胞增殖無明顯抑制作用。
　　 7.G250-ZD55-Ki67能誘導(dǎo)腎癌786-0細(xì)胞的凋亡,與其它組比較,