rAAV2介導(dǎo)IGF-Ⅰ基因聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨骼肌鈍挫傷小鼠修復(fù)作用的研究.pdf

1、骨骼肌損傷的防治一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，其傷后炎癥反應(yīng)期長(zhǎng)，愈合質(zhì)量較差，容易形成瘢痕愈合。盡管國(guó)內(nèi)在分子生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但是目前在臨床仍未能找到預(yù)防和治療骨骼肌損傷公認(rèn)的最佳方案。
　　研究目的：本實(shí)驗(yàn)對(duì)ICR小鼠進(jìn)行骨骼肌鈍挫傷造模后，采用rAAV2介導(dǎo)的胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，對(duì)急性骨骼肌鈍挫傷小鼠進(jìn)行干預(yù)治療，從組織學(xué)、生物化學(xué)等不同的研究層次和角度，探討基

2、因及間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨骼肌損傷的治療作用及可能機(jī)制，比較單純基因治療、單純間充質(zhì)干細(xì)胞、以及兩者聯(lián)合干預(yù)對(duì)骨骼肌鈍挫傷小鼠的修復(fù)效果，豐富相應(yīng)研究資料。
　　研究方法：動(dòng)物分組與處理：將68只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（4只）和實(shí)驗(yàn)組（64只），實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骼肌鈍挫傷造模后平均分為四組，每組16只，各實(shí)驗(yàn)組又根據(jù)取材時(shí)間不同，分為傷后3天組，傷后7天組，傷后14天組，傷后21天組?；蛑委熃M（rAAV-IGF-Ⅰ）在造模后即刻

3、用微量注射器注射40μL重組腺相關(guān)病毒，間充質(zhì)干細(xì)胞組（MSC）注射106個(gè)細(xì)胞，聯(lián)合治療組(rAAV-IGF-Ⅰ-MSC)注射經(jīng)腺相關(guān)病毒感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞106個(gè)，自然愈合組注射40μL PBS。
　　分別在損傷后3d、7d、14d、21d處死動(dòng)物，眼球取血，留取血清，Eppendoff管密封保存于-80℃冰箱待測(cè)；速取損傷區(qū)域腓腸肌，用生理鹽水將殘留血液清洗干凈，其中二分之一置于凍存管中在液氮中速凍3-4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至-

4、80℃冰箱保存待測(cè)，另外二分之一肌肉用10％福爾馬林固定，用于HE染色觀察及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　研究結(jié)果：（1）重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的近紅外熒光蛋白 iRFP713能夠在受傷肌肉組織中廣泛表達(dá)，對(duì)照組無(wú)表達(dá)。（2）HE染色光鏡觀察、血漿CK活性變化表明 MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能促進(jìn)小鼠急性腓腸肌鈍挫傷后的肌肉再生，減少疤痕形成，提高愈合質(zhì)量。（3）外源 IGF-Ⅰ能在小鼠腓腸肌中穩(wěn)定表達(dá)，在第

5、14d時(shí)，IGF-Ⅰ含量從高到低分別為rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組、rAAV-IGF-Ⅰ組、MSC組、自然愈合組、安靜對(duì)照組。（4）MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能抑制骨骼肌鈍挫傷小鼠局部組織Collagen-Ⅰ、Ⅲ mRNA的表達(dá)，第7d、14d、21d,Collagen-Ⅰ mRNA的表達(dá)量均低于自然愈合組（P＜0.01），第3d，rAAV-IGF-Ⅰ組與自然愈合組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余

6、兩組差異顯著（P＜0.05）。第14d，rAAV-IGF-Ⅰ-MSC與 MSC組也表現(xiàn)出非常顯著性差異（P＜0.01）。21天，rAAV-IGF-Ⅰ組是MSC組的76%（P＜0.01），rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組是MSC組的58%（P＜0.01）。小鼠發(fā)生急性骨骼肌損傷3天和第7天時(shí)，各治療組Collagen-Ⅲ mRNA的表達(dá)量與自然愈合組相比均有顯著性差異（P＜0.01），組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。第14d，MSC組是自

7、然愈合組的74%（P＜0.05），rAAV-IGF-Ⅰ組是自然愈合組的63%（P＜0.01），rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組自然愈合組的42%（P＜0.01）。rAAV-IGF-Ⅰ-MSC組的Collagen-Ⅲ mRNA的表達(dá)量與MSC組相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。第21天，rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC兩組的Collagen-Ⅲ mRNA的表達(dá)量均低于自然愈合組（P＜0.01）。
　　研究結(jié)論：（