PGE2-EP2介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向急性肺損傷小鼠肺組織歸巢的效應(yīng)和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 高表達(dá)EP2的MSC向急性肺損傷小鼠肺組織的歸巢及其肺保護(hù)效應(yīng)的研究
　　目的:研究EP2高表達(dá)對(duì)MSC向損傷肺組織歸巢及其肺保護(hù)效應(yīng)的影響。
　　方法:慢病毒介導(dǎo)的EP2轉(zhuǎn)染小鼠MSC，轉(zhuǎn)染MSC分成兩組:①僅轉(zhuǎn)染含報(bào)告基因的Lenti-GFP，記為MSC-GFP組;②轉(zhuǎn)染含報(bào)告基因的Lenti-GFP以及含目的基因的Lenti-EP2，記為MSC-EP2組。慢病毒轉(zhuǎn)染后，采用熒光顯微鏡觀察評(píng)估轉(zhuǎn)染效率以確定最高

2、效MOI值。并利用RT-PCR和Western-blot分別測(cè)定轉(zhuǎn)染前后EP2 mRNA及EP2蛋白的表達(dá)水平。此外，將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為Control組(NS+PBS)，ALI組(LPS+PBS)，MSC-GFP組(LPS+MSC-GFP)，MSC-EP2組(LPS+MSC-EP2)，氣道內(nèi)注入LPS構(gòu)建ALI小鼠模型，造模4h后按分組給予不同處理，24h和72h后分別進(jìn)行下列檢測(cè):(1) MSC-EP2移植后向損傷肺組織歸巢

3、情況:分別使用近紅外離體肺臟成像及肺組織熒光鏡檢評(píng)價(jià)MSC-EP2細(xì)胞在損傷肺組織內(nèi)的靶向歸巢作用;(2) MSC-EP2移植對(duì)ALI小鼠肺血管內(nèi)皮的修復(fù)作用:計(jì)算肺濕重/體重比評(píng)價(jià)肺水腫程度，伊文思藍(lán)漏出實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)肺微血管內(nèi)皮通透性;(3) MSC-EP2對(duì)ALI小鼠肺病理損傷程度的影響:HE染色行組織病理學(xué)檢查并進(jìn)行肺損傷評(píng)分以評(píng)價(jià)肺損傷嚴(yán)重程度;(4) MSC-EP2對(duì)肺組織局部炎癥反應(yīng)的影響:ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿中IL-1β

4、、TNF-α、IL-10的濃度評(píng)價(jià)肺部炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，從而綜合評(píng)價(jià)高表達(dá)EP2的MSC向ALI小鼠肺損傷組織歸巢和促進(jìn)肺損傷修復(fù)的作用。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了高表達(dá)EP2的MSC細(xì)胞株:RT-PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與MSC-GFP相比，含目的基因的Lenti-EP2轉(zhuǎn)染的MSC細(xì)胞內(nèi)EP2 mRNA及EP2蛋白的表達(dá)水平均明顯增高(P＜0.05），提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建了高表達(dá)EP2的MSC細(xì)胞株。(

5、2) MSC-EP2能夠更加有效地歸巢至損傷肺組織:近紅外成像及肺組織免疫熒光檢測(cè)結(jié)果均顯示，與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組中小鼠肺臟的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05），提示EP2高表達(dá)的MSC能夠更加有效地歸巢至肺組織。(3) MSC-EP2可更顯著改善肺水腫程度:肺濕重與體重比值結(jié)果顯示，與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組肺水腫程度明顯減輕（P＜0.05）。(4) MSC-EP2可更有效的改善LPS誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮通

6、透性的增加:伊文斯藍(lán)通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MSC-GFP相比，MSC-EP2組肺組織中伊文斯藍(lán)的濃度明顯下降（P＜0.05），提示EP2高表達(dá)的MSC能夠進(jìn)一步降低ALI肺血管通透性。(5) MSC-EP2更能夠改善肺部炎癥反應(yīng):通過ELISA檢測(cè)肺部炎癥因子水平發(fā)現(xiàn)，與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組小鼠肺組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平明顯下降，而抑炎細(xì)胞因子IL-10的水平明顯升高(P＜0.05），提示EP2高

7、表達(dá)的MSC能夠進(jìn)一步改善ALI的肺部炎癥反應(yīng)。(6) MSC-EP2移植對(duì)ALI小鼠存活率的影響:與MSC-GFP組相比，MSC-EP2組急性肺損傷小鼠的存活率無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:EP2高表達(dá)的MSC能夠更有效地歸巢至ALI小鼠肺組織，從而提高M(jìn)SC促進(jìn)肺血管內(nèi)皮的修復(fù)、改善肺血管的通透性、降低肺部炎癥反應(yīng)、減輕LPS引起的肺組織病理損傷的作用，最終增強(qiáng)MSC的肺保護(hù)效應(yīng)。該研究為提高M(jìn)SC對(duì)ALI的療效提供

8、了新的方向。
　　第二部分 PGE2/EP2介導(dǎo)MSC向損傷肺組織遷移的分子機(jī)制
　　目的:探討PGE2促進(jìn)高表達(dá)EP2受體的MSC向損傷肺組織歸巢的分子機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分組:①未接受PGE2處理的MSC，記為MSC組;②接受PGE2處理的MSC，記為MSC+PGE2組;③接受PGE2處理的MSC-EP2，記為MSC-EP2+PGE2組。分別做如下檢測(cè):(1) Transwell試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)檢測(cè)MSC的垂直遷移

9、和水平遷移能力，明確PGE2/EP2在EP2促進(jìn)MSC遷移中的作用。(2) Western Blot檢測(cè)MSCs細(xì)胞中FAK和及其下游信號(hào)分子ERK1/2的磷酸化表水平，以明確FAK及其下游信號(hào)分子ERK1/2是否參與了PGE2/EP2介導(dǎo)的MSC遷移。(3)分別使用FAK抑制劑PF573228和ERK1/2抑制劑PD98059預(yù)處理MSC及MSC-EP2，再分別行Transwell試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)檢測(cè)MSC及MSC-EP2的垂直遷移和水

10、平遷移能力，以闡明FAK途徑及其下游信號(hào)分子ERK1/2在EP2高表達(dá)促進(jìn)MSC遷移中的地位。
　　結(jié)果:(1) PGE2/EP2是EP2促進(jìn)MSC遷移的重要通路:與MSCs對(duì)照組，PGE2處理組的MSCs水平和垂直遷移率均顯著增加(P＜0.05)，提示PGE2可促進(jìn)MSC遷移;與MSC+PGE2組相比，MSC-EP2+PGE2組的細(xì)胞水平和垂直遷移明顯增加(P＜0.05)，提示PGE2通過EP2受體促進(jìn)MSC遷移。(2) PGE

11、2/EP2介導(dǎo)的MSC-EP2遷移與FAK途經(jīng)的活化有關(guān):與對(duì)照組MSC相比，MSC+PGE2組中MSCs細(xì)胞內(nèi)FAK磷酸化表達(dá)水平呈增加趨勢(shì)，而MSC+PGE2組相比，MSC-EP2+PGE2組中MSCs細(xì)胞內(nèi)FAK磷酸化表達(dá)水平亦呈增加趨勢(shì)，并且與MSC組相比，MSC-EP2+PGE2組中MSCs細(xì)胞中FAK磷酸化表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05)，提示FAK信號(hào)通路參與了PGE2/EP2介導(dǎo)的MSC遷移。(3) FAK途徑下游信號(hào)分

12、子ERK1/2參與了PGE2/EP2通路介導(dǎo)的MSC-EP2遷移:與對(duì)照組MSCs相比，給予PGE2刺激的MSC細(xì)胞中的ERK1/2磷酸化水平明顯較高(P＜0.05);而與MSC組相比，EP2高表達(dá)的MSC中ERK1/2磷酸化水平明顯增高(P＜0.05)，提示ERK1/2信號(hào)通路參與了PGE2/EP2介導(dǎo)的MSC遷移。(4) FAK抑制劑PF573228能夠抑制PGE2對(duì)MSC-EP2遷移的趨化作用:transwell和劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示

13、，與MSC組相比較，MSC+PF573228組MSCs的垂直和水平遷移均明顯減少(P＜0.05);與MSC-EP2組相比較，MSC-EP2+PF573228組MSC的垂直和水平遷移也明顯減少(P＜0.05)，進(jìn)一步提示FAK信號(hào)通路參與了PGE2/EP2介導(dǎo)的MSC遷移。(5) ERK1/2抑制劑PD98059能夠抑制PGE2誘導(dǎo)的MSC-EP2遷移:transwell和劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，與MSC組相比較，MSC+PD98059組MSC

14、s的垂直和水平遷移均明顯減少(P＜0.05);與MSC-EP2組相比較，MSC-EP2+PD98059組MSC的垂直和水平遷移也明顯減少(P＜0.05)，進(jìn)一步ERK1/2信號(hào)通路參與了PGE2/EP2介導(dǎo)的MSC遷移。
　　結(jié)論:(1) PGE2能夠促進(jìn)MSC-EP2細(xì)胞遷移。(2) FAK及其下游的ERK1/2是PGE2/EP2介導(dǎo)MSC遷移的關(guān)鍵信號(hào)分子。(3)高表達(dá)EP2受體能夠通過增強(qiáng)FAK通信號(hào)通路的激活及其下游信號(hào)分