ROCK1介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞功能的非基因組機(jī)制研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid GC)主要由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌，是一種具有重要生理及藥理作用的甾體類激素，在機(jī)體的發(fā)育、分化以及代謝、抗炎、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用。糖皮質(zhì)激素在不同的細(xì)胞類型中均發(fā)揮重要作用。
　　 當(dāng)機(jī)體受到多種有害刺激，例如：應(yīng)激、缺氧、創(chuàng)傷和手術(shù)等的時候，糖皮質(zhì)激素通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的刺激而分泌增多。長期以來，人們普遍認(rèn)為GC的作用機(jī)制為基因組效應(yīng)，即糖皮質(zhì)激素在胞膜轉(zhuǎn)

2、運(yùn)蛋白協(xié)助下或者自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，與細(xì)胞漿中的受體結(jié)合，在分子伴侶蛋白如HSP90的幫助下轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，隨后與靶基因啟動子附近的特異性的反應(yīng)元件結(jié)合，增強(qiáng)或者抑制靶基因的表達(dá)，而發(fā)揮其生理學(xué)和藥理學(xué)的作用。但是后來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GC的作用也可通過另外的一種途徑發(fā)揮效果，該途徑反應(yīng)時間短，且基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯抑制劑均不能阻止該效果，提示其不經(jīng)過基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成過程。人們稱為“非基因組效應(yīng)”或“快速效應(yīng)”。
　　 現(xiàn)在普遍認(rèn)

3、為GC的治療作用是通過4種不同的機(jī)制來實現(xiàn)的：1)GC與胞質(zhì)內(nèi)GC的受體(cGCR)結(jié)合而發(fā)生的經(jīng)典的基因組效應(yīng)。2)GC與cGCR結(jié)合產(chǎn)生的非基因組效應(yīng)。3)GC與GC的膜受體(mGCR)結(jié)合而產(chǎn)生的非基因組效應(yīng)。4)GC與細(xì)胞膜相互作用而產(chǎn)生的非特異性非基因組效應(yīng)。
　　 在急性炎癥反應(yīng)中，炎性細(xì)胞的過度激活是造成機(jī)體損傷的關(guān)鍵因素。在急性炎癥中，中性粒細(xì)胞大量釋放內(nèi)容物、巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)以及炎性細(xì)胞粘附力血管內(nèi)皮細(xì)胞能

4、力增強(qiáng)都會對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷。其中釋放內(nèi)容物和粘附聚集是造成機(jī)體損傷的重要因素。而臨床上常通過使用大劑量的糖皮質(zhì)激素來迅速抑制急性炎癥的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制并不清楚。
　　 近年來，炎癥疾病中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子ROCK(Rho-associated coiled-coil proteinkinase)引起人們越來越多的關(guān)注。ROCK屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，以兩種同源性極高的異構(gòu)體形式存在(ROKα/ROCK2和ROKβ/RO

5、CK1)。已被證實ROCK1在急性肺損傷、心血管疾病和缺血性腦損害等多種炎癥疾病中起重要作用。通過下調(diào)ROCK1的表達(dá)及活性，或者使用ROCK抑制劑--法舒地爾(Fasudil)可有效減輕上述炎癥反應(yīng)。且有實驗證明炎癥細(xì)胞粘附作用主要受ROCK1水平的調(diào)控。
　　 糖皮質(zhì)激素是否可通過ROCK1而發(fā)揮其抗炎效應(yīng)？如果是的話，哪些是通過基因組效應(yīng)，還是非基因組效應(yīng)，尚不明確。
　　 本研究分別以中性粒細(xì)胞和U937單核細(xì)胞

6、這兩種在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞為模型；以佛波酯(phobrolmyristateacetate，PMA)為刺激物；檢測糖皮質(zhì)激素是否通過非基因組效應(yīng)抑制中性粒細(xì)胞和U937單核細(xì)胞的功能。并觀察ROCK1在其中所起的作用。
　　 主要研究內(nèi)容及結(jié)論：
　　 1.采用Ficoll-泛影鈉法分離大鼠中性粒細(xì)胞。該梯度離心大鼠外周血的方法可分離出純度及活力較高的中性粒細(xì)胞。
　　 2.10-6M和10-7M的地塞

7、米松可在短時間(5min、15min、30min)內(nèi)對中性粒細(xì)胞在PMA刺激下釋放的超氧化物陰離子(Superoxide anion O2-)和髓過氧化物酶(Myeloperoxidase MPO)產(chǎn)生明顯的抑制效果。并且該效果并不被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑-米非司酮(Mifepristone RU-486)和蛋白質(zhì)合成抑制劑-放線菌酮(CycloheximideCHX)所扭轉(zhuǎn)。結(jié)果說明10-6M和10-7M的地塞米松抑制中性粒細(xì)胞釋放O2

8、-和MPO過程屬非基因組效應(yīng)。
　　 3.ROCK特異性抑制劑--法舒地爾在短時間內(nèi)對中性粒細(xì)胞釋放O2-和MPO無顯著性抑制作用。提示ROCK并不是該過程的重要調(diào)控因子。
　　 4.當(dāng)給予地塞米松處理后，可在短時間(30min)內(nèi)有效抑制U937單核細(xì)胞對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的粘附作用。該作用并不被米非司酮和放線菌酮所抑制。實驗結(jié)果說明該作用同樣是通過非基因組效應(yīng)而發(fā)揮作用。
　　 5.法舒地爾也可以

9、顯著降低U937細(xì)胞的粘附，提示ROCK1是單核細(xì)胞粘附中的重要影響分子。該抑制效果與地塞米松相似，由此推測地塞米松可通過抑制ROCK1功能而產(chǎn)生抑制U937單核細(xì)胞粘附的作用。
　　 6.U937細(xì)胞內(nèi)的ROCK1的活性可被地塞米松和法舒地爾所有效抑制。地塞米松的該作用并不被米非司酮和放線菌酮所抑制，但ROCK1蛋白表達(dá)不受影響。該結(jié)果說明U937抑制ROCK1功能是通過非基因組效應(yīng)。
　　 7.地塞米松對U937細(xì)胞

10、內(nèi)RhoA含量和活性并無顯著性影響。提示地塞米松并不通過RhoA而影響其下游的ROCK1的功能。
　　 主要結(jié)論：
　　 1.較高濃度的地塞米松(10-6M、10-7M)可在短時間內(nèi)快速抑制受PMA刺激的中性粒細(xì)胞釋放MPO和O2-。而較低濃度的地塞米松和法舒地爾則無此效應(yīng)。提示地塞米松的抑制作用通過非基因組途徑發(fā)揮作用。
　　 2.ROCK1在U937粘附HUVEC過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。地塞米松可通過抑制ROC