人卵巢癌CD24-表型細胞的干細胞特征及上皮--間質(zhì)轉(zhuǎn)變的體外研究.pdf

1、上皮細胞通過細胞極性和細胞間粘附和緊密連接而發(fā)揮功能,但同時也限制了遷移的能力。研究發(fā)現(xiàn),上皮細胞在一些因素的作用下,可發(fā)生細胞極性和細胞間粘附或緊密連接的丟失,并得浸潤性游走遷移能力,被稱為上皮問質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial to mesenchymal transition),即EMT。EMT與惡性上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞(Cancer stem cells,CSCs)也具有EMT能力。我們的前期研究已成

2、功分離、鑒定了上皮性卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞(CSC-LCs),并初步發(fā)現(xiàn)了該細胞的EMT特征。盡管卵巢癌細胞化療耐藥與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變之間的關(guān)系已經(jīng)有相關(guān)文獻報道,且腫瘤干細胞的耐藥能力也在先前的研究中得到了證實,但是對卵巢癌腫瘤干細胞本身如何發(fā)生EMT的研究還有待完善。原癌基因Cyclin D1在維持腫瘤細胞未分化狀態(tài)及非錨著懸浮生長中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,且多項研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1與多種實體腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān),我們推測該

3、基因在維持卵巢癌腫瘤干細胞自我更新和EMT能力中可能發(fā)揮著重要作用。本研究以卵巢腺癌細胞系3AO為模型,從細胞增殖、細胞凋亡、干細胞相關(guān)基因表達分析等對CD24-表型細胞的腫瘤干細胞特征進行更深一步的驗證,并對CD24-細胞的形態(tài)學(xué),生物學(xué)特性及CyclinD1可能的作用進行觀察研究。旨在闡明卵巢腺癌細胞系3AO中腫瘤干細胞樣細胞的間質(zhì)細胞特征并具備EMT能力,而Cyclin D1參與其中并發(fā)揮了重要作用,提示腫瘤干細胞樣細胞的EMT過

4、程參與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移的重要性。
　　 第一部分人卵巢癌CD24-表型細胞的干細胞特征的體外研究目的:
　　 通過比較CD24-與CD24=細胞的增殖、凋亡能力和分析干細胞相關(guān)基因Bmi-1和Oct-4的表達,闡明人卵巢癌CD24-表型細胞的干細胞特征。
　　 方法:
　　 利用無血清微球體培養(yǎng)法獲得3AO腫瘤干細胞樣懸浮球體,利用流式細胞分選法分選CD24-及CD24+細胞亞群,采用MTT法檢測增殖能力

5、,PE-FITC-PI三色熒光標記法檢測不同亞群細胞耐受化療藥物誘導(dǎo)凋亡的能力,Real-time PCR法檢測干細胞相關(guān)基因Bmi-1和Oct-4的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.3AO細胞能在無血清條件下形成自我更新的懸浮球體;
　　 2.3AO細胞中CD24-亞群在低血清狀態(tài)下比CD24+亞群具有更強的增殖能力;
　　 3.3AO細胞中CD24-亞群比CD24+亞群更能夠耐受卡鉑誘導(dǎo)的晚期凋亡;

6、r>　　 4.CD24-細胞高表達干細胞標記物Bmi-1,并且該基因隨著細胞分化表達下調(diào);
　　 5.Oct-4在CD24-和CD24+細胞中表達沒有差異,但能隨著細胞分化表達下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CD24-細胞能夠在低血清環(huán)境中持續(xù)增殖,并且能夠耐受化療藥物卡鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡,提示該表型細胞具有干細胞高增殖力的特性。
　　 2.干細胞標記物Bmi-1在CD24-細胞高表達,且隨著分化表達下調(diào)

7、,提示Bmi-1在維持卵巢癌CSC-LCs的自我更新能力中的作用具有特異性。
　　 3.干細胞標記物Oct-4在CD24-、CD24+細胞均高表達,且均能隨著分化表達下調(diào),在維持以CD24-為表型的卵巢癌CSC-LCs的自我更新能力中的作用不具備特異性。
　　 第二部分CycIin D1參與維持卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞EMT能力的體外研究目的:探討Cyclin D1在維持3AO細胞系中腫瘤干細胞樣細胞EMT能力中的作用及可

8、能的機制。
　　 方法:
　　 觀察新鮮分選的CD24-和CD24+細胞在分化培養(yǎng)基條件下細胞形態(tài)的變化,劃痕試驗檢測富集CD24-表型的懸浮球體細胞的遷移能力,Real-time PCR法檢測EMT相關(guān)分子E-cadherin和Vimentin的表達。合成特異性靶向Cyclin D1的siRNA,轉(zhuǎn)染入3AO球狀細胞中,沉默Cyclin D1的表達,觀察沉默后3AO懸浮球狀細胞增殖、凋亡、遷移能力的變化以及EMT相關(guān)分

9、子的表達改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.CD24-細胞的形態(tài)具有間質(zhì)細胞特點,隨著分化重新形成鋪路石樣形態(tài);
　　 2.富集CD24-表型的懸浮球體細胞具有更強的遷移能力;
　　 3.CD24-細胞缺失表達粘附分子E-cadherin,并且隨著細胞分化重新獲得表達;
　　 4.CD24-細胞高表達波形蛋白Vimentin,并且隨著細胞分化表達下調(diào)。
　　 5.Cyclin D1沉默后球狀細

10、胞增殖能力下降;
　　 6.Cyclin D1沉默后球狀細胞遷移能力下降;
　　 7.Cyclin D1沉默后球狀細胞凋亡能力增加;
　　 8.Cyclin D1沉默后伴隨著EMT相關(guān)分子N-cadherin和Vimentin的表達下調(diào);
　　 結(jié)論:
　　 1.CD24-細胞具備EMT表型,并且該表型隨著細胞分化會發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
　　 2.Cyclin D1能促進卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞增殖、