SSL5激活血小板產(chǎn)生血小板微粒對(duì)THP-1細(xì)胞的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生與多種心血管危險(xiǎn)因素相關(guān)。近年來(lái),“感染負(fù)荷”已被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化新的危險(xiǎn)因素。因此,感染因素對(duì)血管病變形成機(jī)制及影響值得深入研究。
　　炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。其中,單核/巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)和泡沫細(xì)胞形成過程中扮演重要角色。血小板被激活后產(chǎn)生血小板微粒(platelet microparticles,PMPs),與單

2、核/巨噬細(xì)胞相互作用,可進(jìn)一步促進(jìn)血管壁炎癥反應(yīng)以及泡沫細(xì)胞的形成。
　　金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5(staphylococcal superantigen-like protein-5,SSL5)是金黃色葡萄球菌(S.aureus)產(chǎn)生的一種分泌型蛋白。我們前期研究發(fā)現(xiàn),SSL5可通過與血小板表面的GPIbα和GPVI結(jié)合而激活血小板?；谏鲜鲅芯?我們推測(cè),SSL5致血管硬化病變形成作用與PMPs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。故本實(shí)

3、驗(yàn)通過研究SSL5激活血小板產(chǎn)生的PMPs(SSL5-PMPs)對(duì)單核細(xì)胞的作用,以及對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響,來(lái)闡明PMPs在SSL5加速血管硬化病變形成中的作用。
　　研究方法:
　　1、SSL5蛋白的表達(dá)與純化
　　按本課題組前期已建立的方法,進(jìn)行SSL5表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及該蛋白的純化。
　　2、PMPs的制備及鑒定
　　1)以SSL5、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)激活人

4、血小板并通過超速離心獲取PMPs。采用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM),以及PE標(biāo)記的抗CD62P單克隆抗體和FITC標(biāo)記的AnnexinV檢測(cè)PMPs,采用激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡對(duì)PMPs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
　　2)采用FCM及FITC標(biāo)記的抗CD41單克隆抗體和PE標(biāo)記的抗CD154(CD40L)單克隆抗體檢測(cè)PMPs的表面特征。
　　3)采用JC-1檢測(cè)SSL5對(duì)血小板線粒體膜電位的影響。
　

5、　3、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1)采用FCM、激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡檢測(cè)PMPs與THP-1細(xì)胞的結(jié)合情況。
　　2)采用FCM檢測(cè)PMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表面Mac-1的活化。
　　3)采用real-time PCR檢測(cè)PMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞IL-1β、TNFa mRNA水平的表達(dá),采用ELISA試劑盒檢測(cè)PMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TNFa蛋白水平的表達(dá)。
　　4)采用油紅O染色檢測(cè)THP-1源性泡沫細(xì)胞中脂滴

6、的含量,并計(jì)數(shù)泡沫細(xì)胞。
　　5)采用real-time PCR檢測(cè)SSL5-PMPs促進(jìn)oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性泡沫細(xì)胞形成過程中LXRα、LXRβ、ABCA1 mRNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、SSL5-PMPs的一般特性
　　FCM檢測(cè)SSL5-PMPs呈PS和CD62P雙陽(yáng)性。SSL5-PMPs表面CD41的陽(yáng)性表達(dá)率為47％,CD62P的陽(yáng)性表達(dá)率為40.6%,PS暴露的陽(yáng)性率為63%和CD

7、40L的陽(yáng)性表達(dá)率為47.6%。SSL5對(duì)血小板線粒體膜電位無(wú)明顯影響。
　　2、SSL5-PMPs對(duì)THP-1細(xì)胞的作用
　　1)SSL5-PMPs與THP-1細(xì)胞結(jié)合情況
　　FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,SSL5-PMPs可與THP-1細(xì)胞結(jié)合,與不含PMPs的上清液對(duì)照組[(16.59±2.938)%]相比,其結(jié)合率顯著增加至(53.39±7.638)%( P<0.05)。同時(shí),掃面電鏡和激光共聚焦顯微鏡也觀察到SSL5

8、-PMPs與THP-1細(xì)胞的結(jié)合。
　　2)SSL5-PMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表面Mac-1的活化
　　FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,SSL5-PMPs可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表面Mac-1活化,其陽(yáng)性率為40.9%。
　　3)SSL5-PMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TNFα,IL-1βmRNA表達(dá)及分泌情況
　　Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與不含PMPs的上清液對(duì)照組相比,SSL5-PMPs和ADP-PMPs可顯著

9、增強(qiáng)THP-1細(xì)胞 TNFα、IL-1βmRNA表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與不含PMPs的上清液對(duì)照組[(320.3士146.5)pg/ml]相比,SSL5-PMPs和ADP-PMPs可使THP-1細(xì)胞分泌TNFa蛋白水平分別增加至(1018±246.5)和(1041±231.7)pg/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、SSL5-PMPs可促進(jìn)oxLDL誘導(dǎo)TH

10、P-1源性泡沫細(xì)胞的形成與oxLDL對(duì)照組相比,隨著PMPs濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積和泡沫細(xì)胞形成數(shù)量也在增加。
　　4、SSL5-PMPs對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞形成過程中LXRα、LXRβ、ABCA1 mRNA表達(dá)的影響
　　Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與oxLDL對(duì)照相比, SSL5-PMPs對(duì)THP-1源性泡沫細(xì)胞形成過程中LXRα、LXRβmRNA表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05);而顯著上調(diào)了ABCA1

11、 mRNA表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、SSL5-PMPs具有PMPs的一般特性,其表面具有表達(dá)CD41、CD62P、CD40L和PS暴露的特征。SSL5-PMPs產(chǎn)生過程與血小板凋亡無(wú)明顯關(guān)系。
　　2、SSL5-PMPs可與THP-1細(xì)胞結(jié)合,誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表面Mac-1的構(gòu)象改變而活化,并上調(diào)THP-1細(xì)胞TNFα、IL-1βmRNA表達(dá)及分泌,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。