藍(lán)萼甲素抑制血小板活性和血栓形成的機(jī)制研究.pdf

1、血小板在動(dòng)脈粥樣硬化以及各種血栓栓塞等心腦血管疾病中發(fā)揮了舉足輕重的作用。研究證明抗血小板藥物能夠用來(lái)預(yù)防及治療各種血栓栓塞的急性臨床事件。而草藥成分被認(rèn)為是開發(fā)抗血小板藥物的重要來(lái)源。藍(lán)萼甲素（glaucocalyxin A，GLA）是從唇科香茶菜屬植物香茶菜〔Isodon japonica（Burrm F）Hara var glaucocalyx(Maxim) Hara〕中提取分離出的一個(gè)二萜化合物。藍(lán)萼香茶菜為民間藥，性味苦、寒，

2、具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎等活性。現(xiàn)代藥理研究表明，藍(lán)萼香茶菜的乙醇提取液能減輕心肌缺血-再灌注損傷，保護(hù)心?。籊LA可以通過抗血小板作用起到活血、心肌保護(hù)作用，如可抑制卡西霉素刺激的兔血小板生成血小板活化因子，能抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的兔血小板血栓素A2生成，并同時(shí)升高前列腺素E2，能顯著抑制ADP、AA和PAF等誘導(dǎo)的兔血小板聚集，顯著升高血小板內(nèi)cAMP水平，能增加機(jī)體對(duì)86Rb的吸收，改善微循環(huán)作用。最新研究發(fā)現(xiàn)GLA還能通

3、過線粒體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。因此，本論文我們進(jìn)一步證明了GLA具有抗血小板作用，并闡明了GLA抑制血小板活化的分子機(jī)制。
　　利用新鮮分離的健康志愿者提供的外周血，我們制備了洗滌血小板用于檢測(cè)GLA對(duì)血小板活化的影響。血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GLA在濃度為0.001μg/ml與0.01μg/ml時(shí)就能顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集（P<0.001和P<0.001），而對(duì)其他血小板刺激劑，諸如 ADP、thrombin、U46619（

4、TXA2模擬物）刺激的血小板聚集無(wú)抑制作用，提示GLA對(duì)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集具有一定的選擇性、專一性。提示 GLA主要是通過作用于血小板表面糖蛋白受體 GPⅥ通路來(lái)起到抑制血小板聚集的作用的。
　　為進(jìn)一步從細(xì)胞以及分子水平探討GLA對(duì)血小板活性影響的機(jī)制，本論文研究了 GLA對(duì)血小板活化信號(hào)通路的影響。膠原蛋白與 GPⅥ結(jié)合后，可引起 Src家族信號(hào)蛋白向GPⅥ胞內(nèi)部位募集并磷酸化，磷酸化后的Src可與GPⅥ胞內(nèi)部位協(xié)同作用，導(dǎo)

5、致Syk的磷酸化進(jìn)而活化PLCγ2；通過一系列信號(hào)傳遞，血小板活化并可發(fā)生形變、黏附、釋放。膠原蛋白受體 GPⅥ信號(hào)傳導(dǎo)途徑的 Src、Syk和PLCγ2酪氨酸磷酸化的抑制作用。
　　研究還發(fā)現(xiàn)GLA能夠降低膠原蛋白刺激的AKT, ERK和p38磷酸化；由于AKT是PI3K通路的標(biāo)志，ERK和p38是MAPK通路的信號(hào)蛋白，所以我們認(rèn)為GLA也能夠抑制PI3K通路和MAPK通路。流體小室實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟隗w外模擬體內(nèi)血管壁損傷導(dǎo)致膠原蛋白

6、暴露，血小板黏附在損傷部位，形成血栓的病理生理過程。在本論文的第四章，通過流體小室實(shí)驗(yàn)，證明藍(lán)萼甲素（GLA）能夠抑制血小板粘附于膠原蛋白的表面。
　　此外，我們通過凝血酶（thrombin）和蛇毒素(convulxin, CVX)誘導(dǎo)的p-selectin分泌(P<0.01)和 Pac-1結(jié)合實(shí)驗(yàn)(P<0.01)，證明GLA在濃度為0.5μg/ml時(shí)能夠抑制血小板由內(nèi)向外的信號(hào)傳導(dǎo)。我們還通過凝收縮塊（clot retracti