天麻提取物抗血小板聚集及抗乙酰膽堿酯酶活性的研究.pdf

1、本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，對具有確切抗血小板聚集活性的天麻提取部位G2<'[1]>進一步用硅膠柱色譜分離劃段，進行活性追蹤；同時對天麻各提取部位進行抗乙酰膽堿酯酶活性的研究。 目的：通過抗血小板聚集實驗、血小板細胞鈣離子測定實驗和乙酰膽堿酯酶實驗，探討天麻治療老年癡呆的有效部位及作用機制。 方法：抗血小板聚集實驗 采用Born氏比濁法，用二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)誘導的家兔體外血小板聚集實驗對分離段G<

2、,2A>、G<,2B>、G<,2C>和G<,2D>進行活性篩選；用ADP、AA和PAF(血小板活化因子)誘導的兔體外血小板聚集實驗對分離組分G<,2B1>、G<,2B2>、G<,2B3>、G<,2B4>和G<,2B5>進行活性篩選：對不同濃度的分離組分G<,2B2>進行抗ADP誘導的兔體外血小板聚集實驗，觀察其作用強度和半數(shù)抑制濃度IC<,50>值；兔耳緣靜脈注射G<,2B2>進行抗．ADP和AA誘導的血小板聚集實驗，觀察其體內(nèi)顯效時間

3、、達峰時間、作用維持時間及最大抑制率；用ADP、AA和PAF誘導的兔體外血小板聚集實驗，觀察1.0mg·mL<'-1>、0.1mg·mL<'-1>和0.01mg·mL<'-1>的天麻素對血小板聚集功能的影響。 血小板細胞鈣離子測定 采用雙波長熒光光度法對分離組分G<,2B2>進行抗血小板聚集作用機制即細胞內(nèi)鈣水平測定，觀察其對ADP誘導的血小板細胞內(nèi)總鈣、內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流的影響：乙酰膽堿酯酶測定 采用改進Ellman法觀察

4、天麻提取部位G1、G2、G3、G4和天麻素對乙酰膽堿酯酶活力的影響。 結(jié)果： 1．采用Bom氏比濁法，用ADP和AA誘導的家兔體外血小板聚集實驗對分離段G<,2A>、G<,2B>、G<,2C>和G<,2D>進行活性篩選：G<,2B>在終濃度2.2mg·mL<'-1>和1.1mg·mL,'-1>時，對ADP和AA誘導的血小板聚集均有明顯的抑制作用，高濃度(2.2 mg·mL<'-1>)所表現(xiàn)出的對聚集率的影響與低濃度(1.

5、1mg·mL<'-1>)相比，差異有非常顯著性意義(p<0.01)。 2．用ADP、AA和PAF誘導的兔體外血小板聚集實驗對分離組分G<,2B1>、G<,2B2>、G<,2B3>、G<,2B4>和G<,2B5>進行活性篩選：G<,2B2>作用較為明顯，在終濃度0.073mg·mL<'-1>時，對ADP誘導的血小板聚集的影響最為顯著，聚集率與對照組相比，差異有非常顯著性意義(p<0.01)：對AA誘導的血小板聚集亦有影響，為16.

6、31±3.89；對PAF誘導的血小板聚集無抑制作用。G<,2B1>在終濃度0.076mg·mL<'-1>時，對ADP、AA、PAF誘導的血小板聚集均有抑制作用，但抑制率不高，分別為25.39±5.29、23.18±3.87和20.88±5.57。 3．對不同濃度的分離組分G<,2B2>進行抗ADP誘導的兔體外血小板聚集實驗：G<,2B2>抗ADP誘導的兔體外血小板聚集作用明顯，且具有濃度依賴性，IC<,50>為61ug.mL<'

7、-1>，當濃度在18ug.mL<'-1>時，與對照組比較差異有顯著性意義(p<0.05)。 4．兔耳緣靜脈注射G282進行抗ADP和AA誘導的兔血小板聚集實驗：G<,2B2>抗ADP誘導的血小板聚集作用最強，10min顯效，30min達峰，注射0.066g/Kg，作用維持120min；靜脈注射0.132g/Kg，作用維持180min，最大抑制率為87.44％。對AA誘導的兔血小板聚集的抑制作用相對較弱，10min顯效，30mi

8、n達峰，注射0.066g/Kg，作用維持60min；注射0.132 g/Kg，作用維持90min，最大抑制率為54.36％。 5．血小板細胞鈣離子測定實驗：G<,2B2>能阻止ADP誘導的細胞內(nèi)鈣的釋放和外鈣的內(nèi)流，在36ug.mL<'-1>。時，對ADP誘導的血小板細胞外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放與對照組相比差異均有非常顯著性意義(p<0.01)。在18ug·mL<'-1>時，僅對外鈣內(nèi)流有阻滯作用，對內(nèi)鈣釋放無影響。 6．乙酰

9、膽堿酯酶實驗：G2在濃度為10.5 mg．mL<'-1>時的酶活力值與PBS組相比，差異具有非常顯著性意義(p<0.01)；G2在1.0mg·mL<'-1>時，與PBS組比較差異具有顯著性意義(p<0.05)；G3在1.7mg·mL<'-1>時，對酶活力的影響與PBS組比較差異也具有顯著性意義(p<0.05)；但中、低濃度的G4對乙酰膽堿酯酶活力影響，與PBS組比較差異均無顯著性意義(p>0.05)。 7．ADP、AA和PAF誘

10、導的兔體外血小板聚集實驗，結(jié)果表明天麻素在1.Omg·mL<'-1>、O.1mg·mL<'-1>和O.0lmg·mL<'-1>下對血小板聚集均無抑制作用：乙酰膽堿酯酶實驗結(jié)果表明：天麻素濃度僅在1.0mg·mL<'-1>時，對乙酰膽堿酯酶活力有影響，與PBS組比較，差異有顯著性意義(p<0.05)。 結(jié)論： 1．G<,2B2>體外、體內(nèi)均有明顯的抗血小板聚集作用，其體外對ADP誘導的血小板聚集功能的抑制作用具有濃度依賴性

11、，IC<,50>為6lμg·mL<'-1>；體內(nèi)抗血小板聚集作用顯效快，維持時間隨著劑量加大而延長。 2．G<,282>抗ADP誘導的血小板聚集作用機制之一是阻止血小板細胞內(nèi)鈣的釋放和外鈣的內(nèi)流。 3．高、中、低濃度的G1、G2、G3和高濃度的G4對乙酰膽堿酯酶活力具有不同程度的抑制作用，G1、G2、G3對乙酰膽堿酯酶活力抑制作用明顯；中、低濃度的G4抑制作用不明顯。 4．所用劑量的天麻素對ADP、AA和PAF誘