基于固定化乙酰膽堿酯酶親和色譜技術(shù)的天然活性成分篩選研究.pdf

1、研究生物活性物質(zhì)對(duì)靶標(biāo)酶活力的影響是發(fā)現(xiàn)高效、低毒、專一性強(qiáng)的新農(nóng)藥的一種有效篩選手段。然而，游離酶因其對(duì)反應(yīng)條件要求苛刻、易失活等缺點(diǎn)不易應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，酶固定化技術(shù)則可克服這些缺點(diǎn)。在農(nóng)藥研究領(lǐng)域，酶固定化相關(guān)研究主要集中于生物傳感器檢測(cè)環(huán)境樣品中的農(nóng)藥殘留或用以降解相應(yīng)的農(nóng)藥，鮮見利用該技術(shù)進(jìn)行農(nóng)藥靶標(biāo)酶抑制劑篩選的報(bào)道。乙酰膽堿酯酶(AChE)作為神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中一種重要的酶類，是很多神經(jīng)毒劑的作用靶標(biāo)酶。本論文以天然產(chǎn)物為資源

2、，利用酶-底物-拮抗劑在害蟲發(fā)生與控制方面的關(guān)鍵作用，以殺蟲劑靶標(biāo)酶-AChE作為識(shí)別工具，利用溶膠-凝膠(sol-gel)技術(shù)將其固定于復(fù)合凝膠載體，制成具有特定酶生物活性的親和色譜柱，并與HPLC系統(tǒng)聯(lián)用，建立基于固定化酶親和色譜技術(shù)的高效、快速殺蟲活性成分檢測(cè)和分析體系。運(yùn)用該體系從植物和內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物中快速篩選具有酶抑制活性的化合物，并進(jìn)行定點(diǎn)分離、結(jié)構(gòu)鑒定和活性驗(yàn)證，為其進(jìn)一步開發(fā)成為天然產(chǎn)物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。
　　

3、論文通過(guò)sol-gel技術(shù)，分別采用sol-gel交聯(lián)法和sol-gel包埋法制備了兩種功能化的復(fù)合凝膠酶固定化材料。優(yōu)化了制備條件（如硅酸酯的用量、制備溫度對(duì)凝膠的影響等）和固定化條件（交聯(lián)劑的用量、反應(yīng)時(shí)間、給酶量、pH、溫度等對(duì)酶固定化的影響），同時(shí)測(cè)定了凝膠的溶脹率，并利用電子掃描顯微鏡分析、紅外光譜對(duì)復(fù)合凝膠載體進(jìn)行了表征。最優(yōu)條件制備的sol-gel交聯(lián)法的酶活回收率為71.3±8.1％，Km值為26.16±0.09 mmo

4、l L-1;sol-gel包埋法的酶活回收率為82.8±6.0％，Km值為27.24±0.13 mmol L-1。通過(guò)酶活回收率、米氏常數(shù)和穩(wěn)定性的對(duì)比分析，最終選擇sol-gel包埋法制備的AChE固定化酶載體裝柱。
　　利用固定化的AChE復(fù)合凝膠載體制備成固定化酶親和色譜柱，用于天然產(chǎn)物中酶抑制劑的篩選。通過(guò)比對(duì)經(jīng)過(guò)固定化酶親和色譜柱和空白載體柱的高效液相色譜圖，定點(diǎn)分離獲得中藥厚樸提取物中被酶吸附的特征組分，經(jīng)鑒定為厚樸酚

5、(1)和和厚樸酚(2)，活性測(cè)定表明它們對(duì)游離AChE的IC50值分別為18.32±2.01 mg L-1和15.19±3.89 mg L-1。酶動(dòng)力學(xué)研究表明1和2對(duì)AChE的抑制均屬于混合型抑制。而不被固定化酶吸附的化合物如槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷(3)和山奈酚-3-O-L-鼠李糖苷(4)對(duì)酶則沒有抑制作用。通過(guò)對(duì)褐飛虱（Nilaparvata lugens）的觸殺生測(cè)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得1和2的LC50值分別為86.32 mg L-1和