家蠶兩種類型乙酰膽堿酯酶基因的分析.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(acetylcholineste7ase，AChE，EC3.1.1.7.)是昆蟲神經傳導中的一種關鍵酶，在膽堿能神經突觸間，通過催化神經遞質乙酰膽堿(acetylcholine，ATCh)來維持神經沖動的正常傳遞。AChE是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標。由于殺蟲劑的大規(guī)模長期的使用，不僅帶來巨大的環(huán)境污染，而且導致許多種昆蟲對殺蟲劑產生了抗性。家蠶是農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對農藥十分敏感的重要經濟昆蟲，也是我國農藥登記中所列

2、環(huán)境生態(tài)的非靶標生物之一。農、林害蟲中約有70％的種屬于鱗翅目，而家蠶作為鱗翅目昆蟲的代表已有長久歷史，所以研究家蠶的乙酰膽堿酯酶基因，可為開發(fā)對害蟲高效而對環(huán)境沒有污染的新型藥劑提供科學依據(jù)，不僅可以縮短藥劑研發(fā)周期，大幅降低研發(fā)成本，還可望開拓農林害蟲新的防治途徑。本研究以家蠶乙酰膽堿酯酶作為研究對象，初步研究了家蠶乙酰膽堿酯酶的生化特性，并設計了特異性的引物，首次擴增得到家蠶兩種類型的ace基因，為家蠶中存在兩個ace的編碼坐位提

3、供了證據(jù)，與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫進行比對后發(fā)現(xiàn)了家蠶aces的基因結構；同時將兩個基因分別轉入大腸桿菌和昆蟲細胞進行了表達研究，制備了多克隆抗體，初步研究了在細胞中表達的家蠶乙酰膽堿酯酶的功能。同時我們表達并回收了家蠅的乙酰膽堿酯酶。主要研究結果如下： 1、對家蠶乙酰膽堿酯酶(AChE)的生化特性進行了研究，結果表明，家蠶AChE水解乙酰膽堿(ATCh)的效率明顯高于丙酰膽堿(PTCh)和丁酰膽堿(BTCh)。在pH8.0和37℃下

4、，酶的活力最高，對氧磷和毒扁豆堿對家蠶AChE酶的抑制中濃度I50分別為9.8×10-7M和4.8×10-7M，同時與蜜蜂和家蠅等昆蟲比較的結果，表明家蠶的乙酰膽堿酯酶的活性只維持在較低的水平，這可能也是家蠶對有機磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑很敏感的一個原因。 2、首次克隆到編碼家蠶乙酰膽堿酯酶的兩個基因，分別命名為Bmacel和Bmace2，為家蠶乙酰膽堿酯酶的雙基因編碼提供了直接的證據(jù)。1型家蠶乙酰膽堿酯酶基因全長3851bp，被

5、2個內含子隔開。2型家蠶ace基因全長大約27kb，基因內含有5個內含子。Bmacel基因編碼區(qū)全長為2052bp，預計編碼683個氨基酸殘基，SignalP預測到一個17氨基酸殘基的信號肽。Bmace2編碼區(qū)長度為1917bp，編碼一個638個殘基的蛋白，預測有一個23個氨基酸殘基的信號肽。同時將兩個基因與電鰩，果蠅等其它昆蟲序列聯(lián)配的結果表明，該基因具有乙酰膽堿酯酶基因的特性：保守的催化三聯(lián)體，6個半胱氨酸殘基形成三對二硫鍵，保守的

6、氧陰離子洞，保守的FGESAG基序。 3、利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，大量表達了融合蛋白GST-AChEl和GST-AChE2，并采用傳統(tǒng)的割膠回收的方法，回收了兩種蛋白，將兩種表達產物免疫家兔，制備了兔抗多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗表明，兩種抗體的效價均為1：6.4×104。 4、將克隆好的兩個基因分別在Bac-to-Bac系統(tǒng)中進行了表達，同時為了提高表達產物的產量，分別構建了去除蛋白C端疏水肽的載體，并分別進行了表達。結

7、果表明，家蠶乙酰膽堿酯酶基因在該系統(tǒng)中得到了正確的表達，但是僅表現(xiàn)出相對較低的活性，糖染色分析證實家蠶乙酰膽堿酯酶是一種糖蛋白。與其它幾種昆蟲乙酰膽堿酯酶的活性比較也發(fā)現(xiàn)家蠶的乙酰膽堿酯酶活性比較低，抑制實驗表明，表達產物對毒扁豆堿和對氧磷更為敏感。2型乙酰膽堿酯酶的Ⅰ50比1型的偏低。 5、克隆了家蠅敏感品系的乙酰膽堿酯酶基因，并分別將該基因轉入原核和真核表達載體進行了表達，在大腸桿菌里的表達產物為無活性的包涵體，蛋白復性后也

8、僅表現(xiàn)出很低的活性。真核表達產物具有良好的生物學活性，我們大量表達了該蛋白,并利用鹽酸普魯卡因胺親和層析的方法，純化了該蛋白，蛋白純化倍數(shù)為41倍，蛋白回收率為17.94％。細胞里表達的粗酶液和純化后的產物對對氧磷和毒扁豆堿的抑制實驗表明純化后的乙酰膽堿酯酶對兩種抑制劑敏感性都有所下降。 6、利用Paupver4.0軟件包，采用鄰接法進行了乙酰膽堿酯酶的進化分析。昆蟲的ace進化主要分為兩大分支，第Ⅰ分支包括同翅目、雙翅目、鱗翅