褐色橘蚜乙酰膽堿酯酶基因的分子特性及功能分析.pdf

1、本學(xué)位論文以橘園重要害蟲褐色橘蚜Aphis(Toxoptera) citricidus（Kirkaldy)為研究對象，基于其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析方法篩選得到2條乙酰膽堿酯酶基因序列，結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)解析這2個基因在褐色橘蚜不同體段及不同發(fā)育階段的表達模式；最后，分別利用RNAi技術(shù)以及真核表達技術(shù)從基因沉默及過表達兩個方面深入解析這2個乙酰膽堿酯酶基因的分子特性和功能，以期為研究褐色橘蚜抗性發(fā)生的分子機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

2、。主要研究結(jié)果如下：
　　1.褐色橘蚜乙酰膽堿酯酶Tcace1和Tcace2基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析
　　基于本課題組測序獲得的褐色橘蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析方法，鑒定得到與昆蟲乙酰膽堿酯酶同源的2條乙酰膽堿酯酶基因的序列信息。利用PCR技術(shù)克隆獲得了褐色橘蚜Tcace1（KP723526）和Tcace2（KP723527）的cDNA全長序列。功能區(qū)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)由這2條基因序列編碼的蛋白質(zhì)為乙酰膽堿酯酶（AChE，E

3、C3.1.1.7），均具備包括?；诖⒋呋?lián)體、氧離子洞、膽堿結(jié)合位點、形成三個分子內(nèi)二硫鍵的6個半胱氨酸殘基和許多芳香族殘基在內(nèi)的乙酰膽堿酯酶典型的保守結(jié)構(gòu)域，表明其具有乙酰膽堿酯酶保守位點，并可能有催化水解活性。通過推導(dǎo)的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)TcAChE1和TcAChE2分屬兩支。此外，這2個乙酰膽堿酯酶與豌豆長管蚜Acyrthosiphon pisum及棉蚜Aphis gossypii乙酰膽堿酯酶同源性最高。

4、　　2.褐色橘蚜Tcace1和Tcace2基因時空表達模式分析
　　采用實時熒光定量PCR技術(shù)對Tcace1和Tcace2在褐色橘蚜不同發(fā)育階段及不同體段的表達特性進行分析。結(jié)果顯示，Tcace1和Tcace2在褐色橘蚜的若蟲期以及成蟲期均有表達，表達量從若蟲期到成蟲期呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，且在無翅成蚜的表達量高于有翅成蚜；兩基因在褐色橘蚜頭、胸、腹皆有表達，且在頭部高表達。
　　3.基于RNAi技術(shù)的褐色橘蚜Tcace1和T

5、cace2基因的功能鑒定
　　使用設(shè)計的飼喂裝置通過飼喂法將Tcace1和Tcace2的dsRNA液導(dǎo)入褐色橘蚜體內(nèi)，利用qPCR技術(shù)檢測褐色橘蚜取食dsRNA不同時間后的沉默效率，發(fā)現(xiàn)在48 h后目的基因的沉默效果明顯，Tcace1和Tcace2的沉默效率分別達到55％和50%，且不存在相互干擾及脫靶效應(yīng)，沉默效率與對照相比存在顯著差異（P＜0.05）。且在48 h內(nèi)，干擾Tcace1基因后褐色橘蚜的死亡率顯著上升。
　　

6、使用LC10-LC20的馬拉硫磷及西維因分別處理飼喂dsRNA48 h后的褐色橘蚜24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組試蟲對藥劑的敏感性顯著上升（P＜0.05）。其中，馬拉硫磷處理Tcace1干擾后的試蟲死亡率達到74%，處理Tcace2干擾的試蟲死亡率為52%，且二者存在顯著差異（P＜0.05）；西維因處理Tcace1干擾后的試蟲的死亡率達到84%，處理Tcace2干擾的試蟲死亡率為59%，且二者存在顯著差異（P＜0.05）。進一步檢測飼喂2個基

7、因的dsRNA48 h后存活褐色橘蚜的乙酰膽堿酯酶活性發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其活性均發(fā)生了顯著變化（P＜0.05）：與對照相比，干擾Tcace1后其活性為61%，干擾Tcace2后其活性為73%。綜上結(jié)果表明，Tcace1和Tcace2在褐色橘蚜對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑敏感性中可能具有重要作用，且Tcace1較Tcace2發(fā)揮的作用更大。
　　4.褐色橘蚜Tcace1和Tcace2基因異源表達及活性分析
　　采用Bac-to-Bac

8、昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達出褐色橘蚜Tcace1和Tcace2的重組蛋白。以乙酰膽堿酯酶的3種典型底物乙酰硫代膽堿碘化物acetylthiocholine iodide(ATCHI)、丁酰硫代膽堿碘化物butyrylthiocholine iodide(BTCHI)及丙炔基硫代膽堿碘化物propinylthiocholine iodide(PTCHI)對表達產(chǎn)物進行酶活性測定發(fā)現(xiàn)，表達TcAChE1和TcAChE2蛋白

9、的Sf9細(xì)胞裂解液的酶活性顯著增高，且對底物的親和性更高，酶促反應(yīng)速率更快，說明Tcace1和Tcace2在Sf9細(xì)胞中得到成功表達，且獲得較高活性的可溶性蛋白。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白TcAChE1比TcAChE2對底物更具親和性。比較分析重組蛋白對10種抑制劑的雙分子速率常數(shù)發(fā)現(xiàn)，抑制劑對TcAChE1的雙分子速率大于TcAChE2，也即TcAChE1對抑制劑更加敏感。這些結(jié)果證實TcAChE1和TcAChE2在褐色橘蚜神經(jīng)突觸

10、內(nèi)水解乙酰膽堿的重要生理功能，更為重要的是進一步說明TcAChE1是褐色橘蚜介導(dǎo)殺蟲劑不敏感性的主要形式。
　　綜上所述，本學(xué)位論文研究綜合利用生化毒理學(xué)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科知識和技術(shù)手段從褐色橘蚜鑒定出介導(dǎo)其神經(jīng)沖動及在對殺蟲劑不敏感性中起重要作用的2個乙酰膽堿酯酶基因，全面解析了這2個乙酰膽堿酯酶基因的序列特征、系統(tǒng)進化關(guān)系、時空表達模式，并且綜合運用RNAi擾和真核表達兩種方法，分別從基因沉默和基因過表達兩個層面對