嗜卷書虱乙酰膽堿酯酶生化毒理學及其基因克隆與序列分析.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(AcIetylcholinesteraSe，ACHE；EC 3.1.1.7)是生物神經(jīng)傳導中的一種關鍵性酶，能夠迅速水解興奮性神經(jīng)遞質乙酰膽堿而保持神經(jīng)突觸傳導的正常進行，是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要作用靶標。害蟲可以通過體內ACHE質與量的變異而對殺蟲劑產(chǎn)生抗性。為了闡明AChE在嗜卷書虱抗性中的作用和地位，以及AChE介導的抗性機理。本論文以重要的儲糧害蟲嗜卷書虱 (Liposcelis bostrychophi

2、la Badonnel)為試驗材料，通過室內飼養(yǎng)并培育出嗜卷書虱的DDVP和PH<,3>抗性品系(DDVP-R和PH<,3>-R)，較為系統(tǒng)地對兩種抗性品系與敏感品系體內的ACHE，從生化毒理學以及基因克隆兩個方面對其進行研究。主要結果如卜： 一、嗜卷書虱ACHE的生化毒理學特性采用微量滴度酶標板法，對嗜卷書虱敏感品系以及2個抗性品系(DDVP-R，RF=22.36和PH<,3>-R，RF=4.51) ACHE的生化毒理學特性進

3、行了較為系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現(xiàn)，嗜卷書虱敏感品系、DDVP-R和PH<,3>-R的酶源蛋白含量之間存在顯著性差異，且2個抗性品系均顯著低于敏感品系。DDVP-R和PH<,3>-RAChE的比活力顯著高于敏感品系。酶動力學特性研究表明，以STChI為底物，兩個抗性品系的動力學參數(shù)之間存在顯著的差異。PH<,3>-R的K<,m>值較敏感品系顯著升高；同時，PH<,3>-R的V<,max>值顯著大于敏感品系，說明該抗性品系的ACHE發(fā)生了質的變

4、化：同時，V<,max>的升高表明該抗性品系中可能存在AChE的過量表達。這種過表達可能是殺蟲劑和熏蒸劑持續(xù)不斷選擇壓力下篩選的結果。DDVP-R的K<,m>和V<,max>較敏感品系均無顯著變化。 對嗜卷書虱AChE的殺蟲劑離體抑制研究作用表明，所選用的六種殺蟲劑對嗜卷書虱各品系AChE都有明顯的離體抑制作用。根據(jù)測得的抑制中濃度(I<,50>)可以看出，與敏感品系相比，2個抗性品系對于敵敵畏、對氧磷、馬拉氧磷和甲基內吸磷的敏

5、感性顯著降低：PH<,3>-R對于西維因和毒扁豆堿的敏感性亦顯著下降，而DDVP-R與敏感品系間無顯著差異。以上研究結果表明，2個抗性品系都存在著對藥劑的普遍不敏感性。 二、嗜卷書虱ACHE基因的克隆根據(jù)實驗室已知的嗜卷書虱AChE cDNA片段設計特異引物，采用cDNA末端快速擴增技術(RACE)，成功的從嗜卷書虱敏感品系中克隆到了編碼ACHE的全長基因，該基因全長2162bp，包括由181個核苷酸組成的5’非編碼區(qū)序列、由1

6、914個核苷酸組成的ORF和由67個核苷酸組成的3’非編碼區(qū)序列。ORF編碼637個氨基酸組成的ACHE前體蛋白，其中包括了由20個氨基酸組成的信號肽。 三、嗜卷書虱ACHE的同源性、功能位點、分子進化分析和同源建模將嗜卷書虱AChE氨基酸序列提交到NCBI，進行蛋白質與蛋白質(BLASTP)同源比對，發(fā)現(xiàn)該序列同時具有Esterase-lipase和COesterase的保守結構域，且具有完整的N端和C端。該序列與黑尾葉蟬Ne

7、photetix cincticeps AChE的同源性最高，達到77％，與其他昆蟲的AChE也都具有較高的同源性。通過對嗜卷書虱、果蠅和電鰩AChE的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)克隆獲得的嗜卷書虱AChE具有AChE家族所有的保守性功能位點：(1)保守的催化三聯(lián)體$239，E368，H482(2)六個保守的半胱氨酸殘基形成三對二硫鍵(C86-113，C293-308，C444-560)；(3)保守的氧陰離子洞G151，G152，A240；

8、(4)FGESAG序列。另外與電鰩乙酰膽堿酯酶相比，嗜卷書虱乙酰膽堿酯酶活性位點谷內排列的9個芳香族氨基酸殘基是保守的(W103，W147，Y163，W272，W322，F(xiàn)331，F(xiàn)372，Y375，W474)。 從GenBank數(shù)據(jù)庫中收集了來自31個物種的45個AChE氨基酸序列，結合嗜卷書虱的AChE氨基酸序列，利用MEGA3.0構建了AChE的分子進化樹。結果表明用于分析的所有的AChE基本可以分為4個大的類群：昆蟲AC

9、HE1類群、脊椎動物AChE類群、昆蟲ACHE2類群、線蟲AChE類群。嗜卷書虱 AChE 基因為黑腹果蠅AChE基因的直向同源基因(orthologousgene)，即Ⅱ型 AChE 基因。 以果蠅(1d×4A)AChE已知的蛋白晶體結構為模板，對嗜卷書虱的AChE進行了同源建模，得到的嗜卷書虱AChE的模擬三維結構模型，并對比電鰩的活性位點氨基酸，在結構中相應位置找到了嗜卷書虱AChE的酶解活性位點 (催化三聯(lián)體：Ser23