嗜卷書虱羧酸酯酶生化毒理學特性及其mRNA表達水平研究.pdf

1、羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE)是昆蟲體內一類水解內源性和外源性物質的解毒酶系，在昆蟲對有機磷殺蟲劑抗性中起著極為重要的作用，在對氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性中亦有一定的作用。本學位論文以廣泛存在于多種儲藏物中的害蟲嗜卷書虱Liposcelis bostrychophila Badonnel為研究對象，測定了其對9種分別屬于有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的敏感性以及3種增效劑(DEF、TPP和D

2、EM)的增效作用，并在此基礎上，對該蟲CarE的生化毒理學特性以及2個CarE基因在mRNA水平的表達進行了研究。主要研究結果如下：
　　 采用藥膜法測定了9種常用殺蟲劑對嗜卷書虱的觸殺毒力。結果表明，使用的5種有機磷類殺蟲劑均對嗜卷書虱具有較高的觸殺毒力，依次為甲基對氧磷＞毒死蜱＞馬拉硫磷＞乙基對氧磷＞氧樂果。其中，甲基對氧磷和乙基對氧磷的毒力相差在3倍以上。在供試的2種氨基甲酸酯類殺蟲劑中，涕滅威的觸殺毒力顯著高于殘殺威，且

3、高于其余供試殺蟲劑。而2種擬除蟲菊酯類殺蟲劑的觸殺毒力均顯著低于其它7種供試殺蟲劑，但具有較好的擊倒作用。綜合分析9種常用殺蟲劑單劑對嗜卷書虱的觸殺毒力發(fā)現，有機磷類殺蟲劑對嗜卷書虱有較好的防治效果。因此在進行書虱防治時，有機磷類殺蟲劑是比較理想的儲糧保護劑。
　　 增效作用測定結果表明，DEF對毒死蜱、馬拉硫磷以及涕滅威具有較強的增效作用(增效倍數分別為7.50、5.90及3.86)，其次，DEF對氧樂果、甲基對氧磷、乙基對氧

4、磷及甲氰菊酯具有一定的增效作用(增效倍數分別為2.19、2.15、1.64及1.43)，而DEF對殘殺威和溴氰菊酯均無顯著增效作用。這暗示酯酶參與了除殘殺威、溴氰菊酯外其它7種殺蟲劑在嗜卷書虱體內的代謝，而且對毒死蜱、馬拉硫磷以及涕滅威的代謝起著重要作用。此外，TPP除了對甲基對氧磷無顯著增效作用外，對其余8種供試殺蟲劑均有不同程度的增效作用，其中對涕滅威具有最強增效作用，增效倍數達6.75。這表明羧酸酯酶極有可能參與了除甲基對氧磷以外

5、所有殺蟲劑的代謝，并且對涕滅威的代謝起著主要作用。DEM對氧樂果、毒死蜱、殘殺威及溴氰菊酯均無顯著的增效作用，其中甚至對氧樂果具有負增效作用；而對其余4種殺蟲劑具有一定的增效作用，但增效倍數均不高，其中對乙基對氧磷的增效作用相對最強為2.97倍。這說明GSTs參與了乙基對氧磷的代謝，而對其它殺蟲劑的代謝貢獻不大。
　　 此外，增效作用測定結果說明在實倉防治中，可以考慮將殺蟲劑與增效劑合理搭配使用，以達到防治書虱的最佳效果。采用微

6、量滴度酶標板法分別測定了以α-NA、β-NA為底物時嗜卷書虱CarE的生化毒理學特性(CarE活性、酶動力學參數、酶促反應的理論最適溫度和最適pH值以及9種常用殺蟲劑的離體抑制作用)。結果表明，以α-NA為底物時，嗜卷書虱CarE酶促反應的理論最適溫度為24.9 ℃、最適pH值為6.5；以β-NA作為底物時，其最適溫度為25.2 ℃、最適pH值6.2。從9種殺蟲劑對嗜卷書虱CarE的抑制中濃度來看，以α-NA或β-NA作為底物時，甲基對

7、氧磷和乙基對氧磷均能高效抑制其活性。其中，與β-NA作為底物相比，當α-NA作為底物時甲基對氧磷和乙基對氧磷的抑制作用則更強。然而，α-NA或β-NA作為底物，溴氰菊酯和甲氰菊酯對嗜卷書虱CarE均無明顯的抑制作用。當α-NA為底物時，其余5種殺蟲劑也體現出較好的抑制作用，依次為馬拉硫磷＞氧樂果＞殘殺威＞涕滅威＞毒死蜱。
　　 當β-NA為底物時，上述5種殺蟲劑對嗜卷書虱CarE的抑制作用依次為馬拉硫磷＞毒死蜱＞氧樂果＞殘殺威＞

8、涕滅威。結果同樣說明書虱CarE普遍對有機磷類殺蟲劑敏感，對擬除蟲菊酯類不敏感。動力學參數測定結果表明嗜卷書虱羧酸酯酶對β-NA的親和力高于對α-NA。此外，研究發(fā)現馬拉硫磷、氧樂果、甲基對氧磷、乙基對氧磷、毒死蜱、涕滅威和殘殺威等7種殺蟲劑均可增強嗜卷書虱CarE對α-NA、β-NA兩種底物的親和力，并降低其催化底物的能力。根據生物測定結果，分析了嗜卷書虱經9種常用殺蟲劑處理30分鐘后，其體內CarE活性變化的時間動態(tài)(處理后6、12

9、、24、36及48 h)。結果表明，分別以α-NA、β-NA兩種底物測得嗜卷書虱CarE的活性并無差異。隨著馬拉硫磷、氧樂果、甲基對氧磷、涕滅威處理嗜卷書虱后，CarE的活性隨著時間的增長表現為先降低后升高，隨后逐漸恢復至對照水平。在乙基對氧磷、毒死蜱、殘殺威和甲氰菊酯處理后的不同時間，嗜卷書虱CarE的活性均受到抑制，其中，毒死蜱的抑制程度最高。在9種供試殺蟲劑中，溴氰菊酯對嗜卷書虱CarE的活性沒有顯著的影響。
　　 此外，

10、在活體條件下測定了9種常用殺蟲劑對書虱羧酸酯酶動力學參數的影響，結果表明9種殺蟲劑在活體條件下的影響不如離體條件下強烈。以α-NA為底物時，測得經馬拉硫磷和毒死蜱處理后，嗜卷書虱CarE的Km和Vmax變化較大；而以β-NA為底物時，除乙基對氧磷和溴氰菊酯外，其它殺蟲劑對該酶的Km和Vmax均有顯著的影響。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術研究了7種常用殺蟲劑對嗜卷書虱酯酶同工酶譜的影響，電泳圖譜分析結果表明，對照組嗜卷書虱酯酶同工酶共有8條譜

11、帶，且相對分子量大的酯酶譜帶占據了很大比例。與對照相比，殺蟲劑處理后嗜卷書虱酯酶同工酶的電泳條帶顏色均變淺，說明其活性受到抑制而降低，且不同的殺蟲劑對不同分子量的同工酶的抑制效果不同，表明這些不同分子量的酯酶在代謝不同的殺蟲劑時作用不同。其中，甲基對氧磷和乙基對氧磷處理后，嗜卷書虱酯酶同工酶譜帶幾乎全部消失，表明嗜卷書虱的酯酶同工酶幾乎都屬于B-酯酶。利用實時熒光定量PCR技術分析了在前期研究中克隆獲得的兩個嗜卷書虱CarE基因(Lb

12、est1和Lb est2 GenBank登錄號：EU854151和EU854152)經3種殺蟲劑(溴氰菊酯、甲基對氧磷和涕滅威)誘導后其mRNA表達的時間動態(tài)(8、12、24、36及48 h)。結果表明Lb est1在甲基對氧磷、涕滅威以及溴氰菊酯處理后其mRNA的表達量均隨時間出現先抑制再上升再恢復至對照水平，其中殺蟲劑處理24 h后其表達量達最高峰，分別為對照的1.418倍、1.315倍及1.49倍。而在溴氰菊酯處理后，Lb est