3種書虱酯酶基因的克隆及其mRNA表達水平研究.pdf

1、西南大學博士學位論文3種書虱酯酶基因的克隆及其mRNA表達水平研究姓名：唐培安申請學位級別：博士專業(yè)：農(nóng)藥學指導(dǎo)教師：王進軍20090401兩南大學博十學位論文其中L b e s t l 基因全長為2 0 4 9 b p ，O R F1 7 1 3b p ，編碼5 7 0 個氨基酸組成的前體蛋白，N 端1 9個氨基酸為信號肽；L b e s t 2 基因全長為2 5 2 5b p ，編碼6 1 7 個氨基酸組成的前體蛋白，其中包括了由1

2、 7 個氨基酸組成的信號肽。根據(jù)在線軟件S c a n P r o s i t e 的算法原理，從2 個基岡的氨基酸序列中均找劍了C a r e 的2 個保守結(jié)構(gòu)域：絲氨酸活性中心( L 6e s t h F G G D P N K V T I F G E S A G ；L be s t 2 ：F G G D P N 砌T L F G E S A G ) 和保守的二硫鍵形成位點( L b e s t l ：E D C L F L N V

3、 F T P ；L be s t 2 ：E D c L Y L ，N Ⅳs P ) 。序列同源性分析表明，嗜卷} 5 虱2 個C a r E 基因與其它昆蟲酯酶基網(wǎng)之間的同源性較低，但在活性中心處的序列則高度保守。1 ．4 嗜卷書虱羧酸酯酶基因m R N A 表達水平研究嗜卷書虱C a r E 基因定量分析結(jié)果表明，L b e s t 2 基岡在敵敵畏和磷化氫抗性品系中的表達量分別為敏感品系的1 ．9 1 和1 ．4 2 倍，且差異達顯

4、著水平( 尸 O ．0 5 ) ，但經(jīng)敵敵畏和磷化氫處理厲其表達水平分別升高了1 ．7 6 和1 ．4 7 倍。C a r E 基岡在不同發(fā)育階段m R N A 表達量的分析結(jié)果表明，L b e s t l 的表達量隨著該蟲生長發(fā)育的進行逐漸降低，至成蟲期時表達水平最低；相反，L b e s t 2 在若蟲期表達水平較低，而在成蟲期表達水平最高。2 嗜蟲書虱乙酰膽堿酯酶基因克隆及其m R N A 表達水平研究2 ．1 嗜蟲書虱乙酰膽堿酯

5、酶基因克隆及序列分析利用R T - P C R 和R A C E 技術(shù)成功克隆獲得嗜蟲書虱2 個A C h E 基因的全長序列，分別命名為L e a c e l ( G e n B a n k 登錄號：E u 8 5 4 1 4 9 ) 和L e a c e 2 ( G e n B a n k 登錄號：E u 8 5 4 1 5 0 ) 。其中L ea c e l 基因全長1 9 5 8 b p ，O R F1 8 9 0b p ，編碼

6、6 2 9 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)；L e a c e 2 基岡全長為2 1 7 1b p ，O R F1 9 1 4 b p ，編碼6 3 7 a a 的前體蛋白，N 端2 0 個氨基酸為信號肽，成熟蛋白的分子量為7 2 ．2 k D a ，理論等電點為4 ．9 9 。這2 個A C h E 氨基酸序列之問的同源性較低( 3 5 ．7 3 ％) 。通過與黑腹果蠅和加州電鰩A C h E 的序列比對發(fā)現(xiàn)，嗜蟲書虱2 個A C h E 基岡

7、均具有A C h E 家族的所有保守性功能位點，如：催化三聯(lián)體、氧陰離子洞等。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模工具，分別以人．J ．酰膽堿酯酶( 1 p o i ：A ) 和果蠅乙酰膽堿酯酶( 1 d ×4 ：A ) 的蛋白晶體結(jié)構(gòu)為模板，對嗜蟲書虱2 個A C h E 的三維結(jié)構(gòu)進行同源建模，并在三維結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了A C h E的酶解活性位點，證明嗜蟲書虱體內(nèi)也存在2 個A C h E 基因。2 ．2 嗜蟲書虱1 3 - a c t i

8、 n 基因克隆及乙酰膽堿酯酶基因m R N A 表達水平研究目前關(guān)于嗜蟲書虱的分子生物學研究較少，在G e n B a n k 中沒有可用作內(nèi)參基岡的序列，因此本研究從嗜蟲書虱體內(nèi)克隆獲得1 3 - a e t i n 基因片段( G e n B a n k 登錄號：F J 0 4 1 l1 7 ) ，該片段長度為8 2 2b p ，編碼2 7 3 個氨基酸殘基，同源性比對分析表明該片段與其它昆蟲的1 3 - a c t i n 基因具