2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:良性前列腺增生癥(BPH)是中老年男性泌尿外科的常見疾病。前列腺是由腺泡和間質(zhì)兩部分組成的異質(zhì)性器官。BPH是一種一間質(zhì)增生為主的疾病,在間質(zhì)增生中間質(zhì)與上皮之間的比例較正常組織有顯著的升高。近年的研究表明,雌激素在間質(zhì)增生的過程中發(fā)揮了重要的作用。
   雌激素作為一種重要的固醇類性激素,廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程。有報(bào)道稱雌激素在前列腺間質(zhì)細(xì)胞中可以參與增殖和分化的調(diào)節(jié)過程,但其作用的分子機(jī)制尚未完全闡明。

2、本文旨在通過分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)手段,研究雌激素在前列腺間質(zhì)細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和平滑肌表型增加的分子機(jī)制,闡明雌激素在BPH發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用,為臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
   方法第一部分:用原代培養(yǎng)的人前列腺間質(zhì)細(xì)胞和人正常前列腺間質(zhì)細(xì)胞系WPMY-1作為實(shí)驗(yàn)材料,添加雌二醇(E2)和BSA-E2刺激細(xì)胞,用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖,用Real-time RT-PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞

3、增殖核抗原(PCNA)的基因和蛋白水平;用Western blot法檢測(cè)雌激素對(duì)于細(xì)胞MAPK途徑重要激酶ERK1/2的激活情況;用PD98059選擇性阻斷MAPK途徑的激活,用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)雌激素刺激后的細(xì)胞增殖情況;使用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)間質(zhì)細(xì)胞中雌激素受體表達(dá)情況,構(gòu)建ERα和GPR30的shRNA質(zhì)粒,檢測(cè)雌激素通過哪種類型受體實(shí)現(xiàn)了快速激活MAPK途徑以及促增殖的作用。
   第二部分:

4、用原代培養(yǎng)的人前列腺間質(zhì)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料,添加E2和BSA-E2刺激細(xì)胞,用Real-time RT-PCR檢測(cè)平滑肌特異基因smoothelin、SM2/SM1的基因表達(dá)水平,以Western blot法檢測(cè)SM-MHC的蛋白水平;用Real-time RT-PCR和雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)TGF-β1的基因和蛋白水平;分別用PD98059、ICI182,780和TGF-β1中和抗體,研究雌激素促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞平滑肌表型增加的信號(hào)通路。

5、
   第三部分:在HEK293細(xì)胞中,用重組腺病毒技術(shù)包裝含有平滑肌特異基因SM22啟動(dòng)子調(diào)控的紅色熒光蛋白(RFP)和CMV啟動(dòng)子調(diào)控的綠色熒光蛋白(GFP)的重組腺病毒;用重組腺病毒感染原代培養(yǎng)的前列腺間質(zhì)細(xì)胞,通過觀察組成型表達(dá)的GFP確定轉(zhuǎn)染效率,并通過感染平滑肌選擇性培養(yǎng)液和普通培養(yǎng)液富集的間質(zhì)細(xì)胞中RFP的表達(dá)情況確定啟動(dòng)子的特異性;使用流式細(xì)胞術(shù)分離RFP+/GFP+的平滑肌細(xì)胞和RFP-/GFP+的成纖維細(xì)胞,

6、用基因芯片的方法對(duì)其進(jìn)行表達(dá)譜分析;用腺病毒感染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雌激素調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞平滑肌表型的作用。
   結(jié)果第一部分:E2和BSA-E2均能夠促進(jìn)前列腺間質(zhì)細(xì)胞的增殖,MAPK信號(hào)通路的選擇性抑制劑PD98059可有效阻斷這一過程。Western blot結(jié)果顯示,雌激素可以快速激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路,引起ERK的磷酸化過程。前列腺間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)ERα和GPR30,而不表達(dá)ERβ。用ERα和GPR30的shRNA質(zhì)粒,

7、闡明了雌激素通過細(xì)胞膜上的ERα快速激活MAPK途徑,進(jìn)而促進(jìn)前列腺間質(zhì)細(xì)胞的增殖。
   第二部分:E2和BSA-E2均能夠明顯的促進(jìn)前列腺間質(zhì)細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞表型;E2和BSA-E2均能夠通過快速激活MAPK途徑促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá);用PD98059、ICI182,780和TGF-β1中和抗體與雌激素共同作用于細(xì)胞,PD98059和TGF-β1中和抗體均能夠部分阻斷E2促進(jìn)平滑肌表型的作用,能夠完全阻斷BSA-E

8、2促進(jìn)平滑肌細(xì)胞表型的作用:ICI182,780能夠部分阻斷E2促進(jìn)平滑肌表型的作用,而對(duì)于BSA-E2引起平滑肌表型的增加,則無明顯的抑制效果,ICI182,780對(duì)于雌激素引起的MAPK途徑激活亦無明顯作用;聯(lián)合使用PD98059和ICI182,780或TGF-β1中和抗體和ICI182,780均能夠阻斷E2促進(jìn)平滑肌細(xì)胞表型的作用。
   第三部分:成功構(gòu)建并包裝了含有平滑肌特異基因SM22啟動(dòng)子調(diào)控的RFP和CMV啟動(dòng)子

9、調(diào)控的GFP的雙熒光重組腺病毒,并在原代間質(zhì)細(xì)胞中獲得了極高的感染效率和特異性;使用流式細(xì)胞術(shù)體外分離經(jīng)過感染的原代培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞,對(duì)RFP+/GFP+細(xì)胞和RFP-/GFP+細(xì)胞使用基因芯片手段進(jìn)行了表達(dá)譜分析;用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合腺病毒感染的方法研究了雌激素促平滑肌細(xì)胞表型的作用,獲得了與第二部分一致的結(jié)果。
   結(jié)論1.在前列腺間質(zhì)細(xì)胞中,雌激素通過細(xì)胞膜上的ERα快速激活MAPK信號(hào)通路,促進(jìn)前列腺間質(zhì)細(xì)胞的增殖。

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