HtrA1通過(guò)TGF-β1-Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的:體外誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞(Human dental pulp cells，hDPCs)成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化，模擬牙本質(zhì)形成過(guò)程，檢測(cè)礦化過(guò)程耐高溫絲氨酸蛋白酶A1(High-temperature requirement protein A1,HtrA1)及TGF-β1/Smad信號(hào)相關(guān)因子的表達(dá)情況，進(jìn)一步檢測(cè)HtrA1抑制對(duì)此礦化過(guò)程及TGF-β1/Smad信號(hào)的影響，探索HtrA1在hDPCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化過(guò)程中對(duì)TGF-β1/

2、Smad信號(hào)通路表達(dá)的影響，探索牙髓保護(hù)及修復(fù)性牙本質(zhì)形成的具體機(jī)制，為尋求臨床上牙髓保護(hù)性治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、體外培養(yǎng)鑒定hDPCs，經(jīng)礦化誘導(dǎo)建立hDPCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的礦化模型，根據(jù)礦化時(shí)間分為0天、7天、14天、21天、28天組，茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性測(cè)定、RT-PCR檢測(cè)礦化相關(guān)因子ALP、Ⅰ型膠原(Co

3、llagen typeⅠ，COLⅠ)及成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子牙本質(zhì)涎磷蛋白(Dentinsialophosphoprotein，DSPP) mRNA的表達(dá)以驗(yàn)證體外礦化模型成功建立。RT-PCR方法檢測(cè)礦化誘導(dǎo)過(guò)程中hDPCs內(nèi)HtrA1及TGF-β1/Smad信號(hào)相關(guān)因子TGF-β1、TβRⅠ、Tβ RⅡ、Smad2、Smad4、Smad6和Samd7的表達(dá)情況。
　　2、構(gòu)建HtrA1基因shRNA(short hairpin

4、RNA)慢病毒載體，包裝后感染人牙髓細(xì)胞，嘌呤霉素穩(wěn)定篩選，檢測(cè)感染后基因干擾效果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察感染細(xì)胞生長(zhǎng)增殖潛力。病毒感染細(xì)胞礦化誘導(dǎo)21天，于不同時(shí)間檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況、ALP活性測(cè)定、礦化相關(guān)因子ALP、COLⅠ及DSPP mRNA的表達(dá)變化情況。同時(shí)檢測(cè)HtrA1及TGF-β1/Smad信號(hào)相關(guān)因子TGF-β1、TβRⅠ、Tβ RⅡ、Smad2、Smad4、Smad6和Samd7的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:<

5、br>　　1、牙髓細(xì)胞傳至第3代，形態(tài)均一，呈典型成纖維細(xì)胞長(zhǎng)梭形。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示波形蛋白染色呈陽(yáng)性著色，角蛋白染色呈陰性著色，提示該細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源。RT-PCR結(jié)果顯示在礦化誘導(dǎo)過(guò)程中隨時(shí)間的延長(zhǎng)礦化結(jié)節(jié)形成持續(xù)增多、ALP活性升高、ALP、COLⅠ及DSPPmRNA表達(dá)逐漸升高。HtrA1 mRNA表達(dá)在礦化誘導(dǎo)第7天達(dá)最高峰，隨后逐漸減弱;TGF-β1 mRNA表達(dá)從第7天開(kāi)始升高，呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)，第21天達(dá)到高峰。Tβ

6、RⅠ和Tβ RⅡ mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與TGF-β1一致;Smad2與Smad4 mRNA的表達(dá)于第14天開(kāi)始升高，在第21天達(dá)到高峰;Smad6及Smad7 mRNA表達(dá)在礦化誘導(dǎo)的前14天無(wú)明顯變化，于第21天升高并維持在較高水平。
　　2、慢病毒感染牙髓細(xì)胞4天后，空白對(duì)照組(Blank組)無(wú)綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞，而陰性對(duì)照組（NC組）和HtrA1抑制組（shHtrA1組）表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞約60％，經(jīng)嘌呤霉素穩(wěn)定篩選兩周后可達(dá)9

7、5％以上。經(jīng)穩(wěn)定篩選后，RT-PCR結(jié)果顯示Blank組與NC組的HtrA1 mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異;shHtrA1組的HtrA1 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于NC組。生長(zhǎng)曲線繪制結(jié)果顯示Blank組、NC組及shHtrA1組的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)相同。與NC組相比，HtrA1抑制后，礦化誘導(dǎo)過(guò)程中礦化結(jié)節(jié)形成減少，ALP活性下降，礦化相關(guān)因子ALP、COLⅠ mRNA表達(dá)顯著降低，DSPP mRNA表達(dá)亦顯著下降。HtrA1抑制后TGF

8、-β1 mRNA表達(dá)隨之下降，其下游各因子TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad4、Smad6及Smad7 mRNA表達(dá)水平較NC組低。
　　結(jié)論:HtrA1、TGF-β1及其受體的表達(dá)在hDPCs的成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化過(guò)程中上調(diào)，下游因子Smad2、Smad4表達(dá)同步增加，通路抑制因子Smad6和Smad7的表達(dá)亦在上游因子表達(dá)高峰時(shí)期增加。而HtrA1抑制能影響 hDPCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的過(guò)程，降低礦化相關(guān)因子的表達(dá);同時(shí)