Smads信號分子在成牙本質細胞分化中作用的研究.pdf

1、該課題研究的目的是觀察Smads信號分子在TGF-β1調控成牙本質細胞分化和細胞外基質蛋白合成中的作用,探討TGF-β1在成牙本質細胞分化和細胞外基質合成中的作用機制.該研究包含三個部分:第一部分:Smads在MDPC-23細胞中的表達、調控及其在TGF-β1信號途徑中作用的研究;在這個部分,首先對從Dr.Jacques E.Nor獲得的成牙本質細胞樣細胞系MDPC-23的生物學特征進行了研究.結果表明MDPC-23保持了其原有的特性,

2、主要包括1)上皮樣細胞形態(tài),有多個細胞膜突起;2)易形成細胞結節(jié),細胞倍增時間少于24h;3)表達I型膠原、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、骨橋素(OPN)和牙本質涎磷蛋白(DSPP).其次,對Smads分子在MDPC-23細胞內的表達、調控及其功能進行了研究.第二部分Smads在TGF-β1調控MDPC-23細胞分化中作用的研究;在這個部分,為了觀察Smads分子在MDPC-23細胞中的作用.用LipofectAMINE法分別將

3、Smad2、Smad3及它們的突變體穩(wěn)定轉染至MDPC-23細胞內,用300μg/ml G418篩選2周后得到陽性克隆.陽性克隆用anti-Flag單克隆抗體通過Western免疫印跡雜交進一步鑒定.接著,研究了Smads是否參與TGF-β1對牙本質細胞外基質蛋白的調控.第三部分Smads在TGF-β1調控DSPP基因轉錄中的作用;為了了解Smads在TGF-β1調控DSPP基因轉錄中的作用.我們首先用PCR方法從小鼠MDPC-23細胞

4、基因組中克隆出部分DSPP啟動子.擴增出的大小為1.5kbp的片段首先用T4連接酶克隆到pGEM-T Easy載體中,正確克隆到pGEM-T Easy載體的片段用DNA測序鑒定.pGL3LUC-1243-+54bp和pGL3LUC-791-+54bp質粒被用來觀察成牙本質細胞內TGF-β1對DSPP表達的潛在調控.進一步觀察轉錄因子c-Jun或c-Fos是否和Smad3協(xié)同調控TGF-β1對DSPP啟動子活性的轉錄抑制作用.C-Jun或