天然免疫受體NOD2在成牙本質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體受到外界刺激時(shí)激發(fā)免疫防御及修復(fù)反應(yīng)以保存功能牙髓。成牙本質(zhì)細(xì)胞是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的特征性細(xì)胞，位于牙髓牙本質(zhì)交界處，是抵抗細(xì)菌和毒性產(chǎn)物在牙髓組織中擴(kuò)散的第一道屏障，在牙髓損傷修復(fù)，尤其早期齲牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體防御修復(fù)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此，成牙本質(zhì)細(xì)胞的健康狀態(tài)反映了牙髓抵御外來(lái)有害刺激的潛能。近年研究發(fā)現(xiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞除具有合成膠原和基質(zhì)的基本功能外，還能產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)和表達(dá)多種免疫受體，進(jìn)而參與牙髓的天然和適應(yīng)性

2、免疫防御反應(yīng)。然而成牙本質(zhì)細(xì)胞如何識(shí)別外來(lái)抗原以進(jìn)行免疫防御的機(jī)制尚不清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)NODs蛋白是胞漿型PRR中的一個(gè)重要家族，與膜型PRR TLRs相似，識(shí)別并結(jié)合病原微生物的PAMPs，啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫應(yīng)答。其中NOD2是研究較多的受體之一，它能與幾乎所有細(xì)菌(尤其G+菌)的PGNs最小免疫活性分子MDP結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)天然免疫，并成為聯(lián)系適應(yīng)性免疫的紐帶。本課題組前期研究已證實(shí)，正常人牙髓組織組成性表達(dá)NOD2蛋白，主要分布于

3、成牙本質(zhì)細(xì)胞層及血管內(nèi)皮細(xì)胞，推測(cè)牙髓組織通過(guò)天然免疫受體NOD2識(shí)別病原微生物，啟動(dòng)牙髓天然免疫。那么，天然的成牙本質(zhì)細(xì)胞是否功能性表達(dá)NOD2，及其下游的效應(yīng)如何，尚未清楚。本研究擬通過(guò)檢測(cè)天然成牙本質(zhì)細(xì)胞中NOD2的表達(dá)情況，建立成牙本質(zhì)樣細(xì)胞體外模型，觀察NOD2受體激活劑MDP刺激成牙本質(zhì)樣細(xì)胞后NOD2受體表達(dá)的變化，及其引發(fā)的下游反應(yīng)，以探討NOD2在成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮免疫防御功能中所起的作用。
　　 目的：本研究通

4、過(guò)檢測(cè)天然免疫受體NOD2在成牙本質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及其引發(fā)的下游效應(yīng)，探討NOD2受體在牙髓組織天然免疫中發(fā)揮的作用，了解牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體在早期齲的免疫防御機(jī)制。
　　 方法：①收集因阻生需要拔除的年輕健康完整第三恒磨牙，分離冠根，摘除牙髓后刮取成牙本質(zhì)細(xì)胞層，real-time PCR及Western blot分別檢測(cè)天然的成牙本質(zhì)細(xì)胞中NOD2 mRNA及蛋白的表達(dá)。②建立成牙本質(zhì)樣細(xì)胞體外模型，并通過(guò)成牙本質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性鑒

5、定培養(yǎng)所獲細(xì)胞：倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；免疫熒光和real-time PCR分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子DSP蛋白及DSPP、DMP-1mRNA表達(dá)情況;ALP活性檢測(cè)及Von Kossa染色檢測(cè)細(xì)胞礦化能力。③利用MDP刺激成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)收集樣本，real-time PCR及Western blot檢測(cè)刺激前后NOD2表達(dá)情況；ELISA檢測(cè)刺激前后細(xì)胞分泌hBD-2及IL-6情況；real-time PCR檢測(cè)

6、刺激前后細(xì)胞內(nèi)DSPP mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：⑴本研究通過(guò)real-time PCR及Western blot檢測(cè)，結(jié)果均顯示天然的成牙本質(zhì)細(xì)胞組成性表達(dá)NOD2。⑵成功建立成牙本質(zhì)樣細(xì)胞體外模型，顯微鏡下觀察可見(jiàn)培養(yǎng)所獲細(xì)胞主要呈多角形，核偏極，部分細(xì)胞可見(jiàn)伸長(zhǎng)的胞漿突起;免疫熒光顯示細(xì)胞內(nèi)DSP蛋白表達(dá)陽(yáng)性；real-time PCR檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)DSPP、DMP-1mRNA，且與天然成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義；ALP活性檢測(cè)顯示培養(yǎng)所獲細(xì)胞較牙髓細(xì)胞具有較高的ALP活性，Von Kossa染色可見(jiàn)較多礦化結(jié)節(jié)的形成，表明其有較強(qiáng)的礦化能力。⑶利用MDP刺激成牙本質(zhì)樣細(xì)胞后，real-timePCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)NOD2表達(dá)上調(diào)，ELISA檢測(cè)到刺激后早期細(xì)胞分泌較多的hBD-2，并在24h內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增高的趨勢(shì)，而IL-6產(chǎn)生量較少，且real-time PCR檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)DSPP mRNA表達(dá)