人呼吸道上皮細胞Nod2受體的表達與調(diào)控—Nods受體在天然免疫中作用的初探.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)近年來頗受關(guān)注，它是生物體賴以生存的最基本條件，是抵御微生物入侵的第一道屏障，是生物體在長期種系發(fā)生和進化過程中逐漸形成的，對各種病原微生物都具有抗感染的作用。與獲得性免疫系統(tǒng)一起組成了人體抵御外界的兩大重要防御機制。 天然免疫識別的是微生物生存所必需的，相對保守的，并且宿主不具備的病原體相關(guān)模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），包括革蘭陰性菌的脂多糖（L

2、PS）、革蘭陽性菌的磷壁酸、病毒的雙鏈RNA、細菌的非甲基化CpGDNA、細菌的蛋白特征分子甲酰甲硫氨酰肽等。而天然免疫系統(tǒng)的受體則稱為模式分子識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）。識別受體是在種系發(fā)生中產(chǎn)生，是長期自然選擇的結(jié)果。目前研究較多的兩種主要的受體分別為Toll受體與Nods蛋白受體。經(jīng)研究表明Nods蛋白受體，主要是Nod1和Nod2，分布在腸道等上皮細胞胞漿中，能識別細菌胞壁肽

3、聚糖成分，能被細胞因子及侵襲性細菌上調(diào)表達，激活NF-K B信號途徑，啟動機體的免疫應答和炎癥反應。 本項研究的目的是檢測呼吸道上皮細胞和膀胱上皮細胞中有無Nod2的表達，并進一步探討其表達的調(diào)控因素以及其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。 首先，我們研究了呼吸道上皮細胞A549和膀胱上皮細胞T24中有無Nod2的表達，并研究了細胞因子，活菌對Nod2的表達有無影響。常規(guī)培養(yǎng)呼吸道上皮細胞株A549和膀胱上皮細胞株T24，用細胞因子TN

4、F-a，以一定的濃度，刺激A549或者T24細胞6小時，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照Genbank上的Nod2序列，設(shè)計跨越內(nèi)含子的引物，并以GAPDH為內(nèi)參照，做半定量：PCR，檢測細胞中Nod2的表達及其表達是否受細胞因子的影響。結(jié)果表明，A549和T24細胞中均有Nod2的基礎(chǔ)表達，但是表達量較低，用細胞因子刺激后表達量明顯增強。 TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠假單胞菌：PAO1及ATCC 27853，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)肺炎

5、克雷伯桿菌KP03183，收集細菌，紫外分光光度計于650nm波長測定OD值，確定細菌濃度。按一定的比例，活菌作用于細胞，分別在不同的時間點提取細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，擴增Nod2片段，并以GAPDH為內(nèi)參照，做半定量PCR，檢測細胞中Nod2的表達是否受活菌刺激的影響。由于活菌中的成分不如細胞因子那樣高純度，且活菌涉及的影響因素（如細胞狀態(tài)、細菌活力等）較多，我們設(shè)計了在不同的時間點觀察Nod2表達的變化。結(jié)果表明，銅綠假單

6、胞菌PA01i在刺激6小時、12小時和24小時都較未刺激組表達量有明顯增加。而銅綠假單胞菌ATCC 27853在刺激12小時比未刺激組表達量有增加。KP03183刺激T24細胞在6小時增加較為明顯。提示細菌活菌能夠刺激上皮細胞Nod2表達的增加，并且隨菌種、時間和濃度的變化，增加的強度有所不同。 我們進一步探討了Nod2介導的天然免疫的信號轉(zhuǎn)導途徑是否與NF．κB信號通路有關(guān)。按照Genbank上有關(guān)的Nod2DNA序列，參考相

7、關(guān)文獻，設(shè)計擴增出含有NF-κ B結(jié)合序列的Nod2上游調(diào)控序列。重組到報告基因載體上，通過檢測熒光素酶活性，判斷刺激因素是否能夠激活Nod2上游調(diào)控序列中的NF-κ B結(jié)合序列。采用細胞因子TNF-a，IFN-γ，IL-1β，以一定的濃度或者濃度梯度，作用于轉(zhuǎn)染過重組報告基因質(zhì)粒的A549細胞，刺激6小時，裂解細胞，裂解液測熒光素酶活性。結(jié)果提示細胞因子刺激后熒光素酶活性顯著增加，并顯示出了TNF-α和TFN-γ的協(xié)同作用。以銅綠假單

8、胞菌（PAO1）活菌刺激細胞，檢測出的熒光素酶活性表現(xiàn)出增加的趨勢，在12小時增加較為明顯。銅綠假單胞菌培養(yǎng)上清刺激細胞，高濃度時熒光素酶活性增加較為明顯。以上實驗結(jié)果提示細胞因子和銅綠假單胞菌（PAO1）活菌能夠刺激上皮細胞中Nod2的表達，并且可能是通過激活NF-кB誘導其表達升高。 上述研究結(jié)果提示，上皮細胞可能通過Nod2蛋白受體感受外來刺激，如細胞因子和細菌活菌等等，激活轉(zhuǎn)錄因子NF－кB，啟動機體的免疫應答和炎癥反應