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文檔簡介
1、目的:為了解TLR家族在RSV誘導(dǎo)氣道上皮細胞炎癥反應(yīng)中的作用,體外培養(yǎng)9HTEo人類氣道上皮細胞株,觀察RSV感染后,9HTEo細胞TLR1-10 mRNA的表達變化。 方法:RSV以MOI為10感染9HTEo細胞3小時后用半定量RT-PCR檢測TLR1-10 mRNA表達;感染3、6和9小時后用Q-PCR檢測TLR1-10 mRNA的動態(tài)變化,并以UV-RSV作為對照。 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果提示RSV感染上皮細胞后
2、TLR2~10mRNA表達均上調(diào),以TLR2和TLR6變化最為顯著;Q-PCR結(jié)果顯示:(1)9HTEo細胞株可表達TLR1-10 mRNA,其中以TLR4和TLR8 mRNA表達最高;(2)RSV感染上皮細胞6小時和\或9小時后,TLR1-10mRNA均表達增高,而UV-RSV組TLRl-10mRNA無明顯變化。 結(jié)論:RSV感染氣道上皮細胞株后,TLR1-10 mRNA均被上調(diào),而無復(fù)制能力的RSV不能引起TLR1-10mR
3、NA表達的變化,提示RSV誘導(dǎo)TLRs mRNA表達與病毒入胞復(fù)制有關(guān)。 目的:觀察RSV感染后,氣道上皮細胞TLR4蛋白表達變化及其信號通路的功能,與RSV在細胞復(fù)制的關(guān)系,進一步探討RSV誘導(dǎo)氣道炎癥的可能機制。 方法:體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-,RSV以MOI為10感染上皮細胞24小時后(1)用流式細胞術(shù)檢測TLR4表達及與凋亡的關(guān)系;(2)用ELISA檢測RSV感染上皮細胞經(jīng)LPS刺激,并加入TLR4
4、阻斷劑HTA125后,上清液中IL-8,IL-6和RANTES的含量;(3)運用TLR4特異性的siRNA干擾9HTEo細胞TLR4表達后,接種RSV并予以LPS刺激,用ELISA法檢測上清液中IL-8,IL-6的水平。用TLR4特異性siRNA干擾9HTEo細胞24小時后,①RSV以MOI為0.1感染細胞,連續(xù)3天收集上清液用Adeasy TCID50法檢測RSV感染性滴度的變化;②RSV以MOI為10感染細胞48小時,ELISA方法
5、檢測上清液中IL-8,IL-6,TNF-α和MCP-1的變化;③RSV以MOI為10感染細胞24小時后,用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。 結(jié)果:RSV感染9HTEo上皮細胞,膜上TLR4表達增高而胞內(nèi)TLR4表達降低,TLR4陽性細胞百分比明顯增加,其中絕大部分為膜Annexin V陽性細胞;LPS誘導(dǎo)的IL-6和部分IL-8可被HTA125阻斷,RANTES無明顯變化;在TLR4表達被干擾的情況下,LPS刺激僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生部分IL
6、-8,不能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6。TLR4-siRNA組的RSV滴度變化與正常9HTEo細胞組無統(tǒng)計學差異;RSV誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1水平在TLR4-siRNA200nM組明顯低于對照組,而IL-8和TNF-α的水平無明顯變化;TLR4-siRNA組RSV誘導(dǎo)AnnexinV陽性同時PI陰性的細胞群體百分比在TLR4-siRNA組明顯高于對照細胞組。 結(jié)論:RSV感染9HTEo細胞后,LPS再刺激產(chǎn)生IL-6是依賴于TLR4信號
7、通路。氣道上皮細胞TLR4通路與RSV復(fù)制、RSV誘導(dǎo)上皮細胞分泌IL-8無關(guān),但與病毒誘導(dǎo)上皮細胞分泌IL-6和MCP-1,以及病毒感染細胞發(fā)生凋亡有關(guān)。 目的:觀察RSV感染9HTEo上皮細胞后,TLR3蛋白表達變化及其信號通路的功能。 方法:體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-,RSV(1)以MOI為1感染上皮細胞24小時后,提取細胞總蛋白,用Westernblot的方法檢測TLR3表達的變化,以TLR3激動劑P
8、olyIC刺激為對照;(2)以MOI為10接種上皮細胞4小時后,直接加入PolyIC到培養(yǎng)上清或用脂質(zhì)體將PolyIC轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)刺激48小時后,用ELISA檢測上清液中IL-8,IL-6,IFN-α和IFN-β的表達。 結(jié)果:RSV感染后9HTEo上皮細胞后,TLR3蛋白表達量明顯增高,再經(jīng)胞內(nèi)TLR3激動劑PolyIC刺激后,培養(yǎng)上清IL-8,IL-6和IFN-β含量明顯增加。 結(jié)論:RSV誘導(dǎo)上皮細胞TLR3蛋白表
9、達增高,TLR3通路可介導(dǎo)IL-8和IL-6和少量IFN-β產(chǎn)生,提示TLR3通路可能主要誘導(dǎo)上皮細胞炎癥反應(yīng)而不是抗病毒反應(yīng)。 目的:以地塞米松和利巴韋林為對照,觀察白藜蘆醇對RSV復(fù)制和對RSV誘導(dǎo)的上皮細胞炎癥反應(yīng)作用及其機制研究。 方法:(1)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-細胞和Hep-2細胞株,RSV以MOI為0.1接種Hep-2細胞和9HTEo細胞4小時后,加入適宜濃度的白藜蘆醇,地塞米松和利巴韋林,
10、連續(xù)5天收集各組上清液,用AdeasyTCID50方法檢測計算RSV滴度的變化;(2)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-細胞,RSV以MOI為10接種9HTEo細胞4小時,將PolyIC轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)后再加入適宜濃度白藜蘆醇,地塞米松或利巴韋林至48小時后,用ELISA檢測上清液中IL-8,IL-6的表達。(3)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-細胞,RSV以MOI為1接種9HTEo細胞4小時,加入適宜濃度白藜蘆醇,地塞米松或利巴
11、韋林,48小時后收集細胞提取蛋白用Westernblot檢測TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達的變化。 結(jié)果:Hep-2細胞-白藜蘆醇100μM處理組和9HTEo細胞-白藜蘆醇處理組的RSV滴度明顯低于單純RSV組,相應(yīng)細胞的地塞米松處理組的RSV滴度無明顯變化,而利巴韋林組的RSV滴度明顯低于單純RSV組。RSV感染9HTEo細胞后,白藜蘆醇組和地塞米松組的IL-6水平明顯降低,但IL-8無明顯變化,利巴韋林組的I
12、L-8和IL-6水平明顯降低;RSV感染9HTEo細胞后再給與胞內(nèi)PolyIC刺激后,白藜蘆醇組,地塞米松組的IL-8和IL-6水平均明顯降低,而利巴韋林組IL-8和IL-6無明顯變化。RSV感染9HTEo細胞后,白藜蘆醇處理組的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達明顯降低,TLR3蛋白無明顯變化;地塞米松組和利巴韋林組的TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白的表達均明顯降低。 結(jié)論:白藜蘆醇可抑制RSV在氣道上皮細胞中的復(fù)制和
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