呼吸道上皮細(xì)胞與致病菌相互作用——上皮細(xì)胞內(nèi)吞細(xì)菌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、呼吸道上皮細(xì)胞是呼吸道防御微生物感染的第一道屏障。上皮細(xì)胞不僅僅是一道阻隔病原體入侵的機(jī)械屏障，更是天然免疫及炎癥反應(yīng)的積極參與者。綠膿桿菌和克雷伯桿菌都是機(jī)會(huì)致病菌，對(duì)正常人不致病，只有免疫功能低下和粘膜上皮細(xì)胞受損或功能失常時(shí)才會(huì)發(fā)生感染。呼吸道上皮細(xì)胞在防御這類機(jī)會(huì)致病菌感染時(shí)發(fā)揮了重要的作用。本研究旨在探討上皮細(xì)胞能否清除進(jìn)入胞內(nèi)的綠膿桿菌，胞內(nèi)模式識(shí)別受體Nods蛋白信號(hào)途徑是否參與清除細(xì)菌的過程，以及防御素是否能通過促經(jīng)克雷

2、伯桿菌粘附到上皮細(xì)胞而被上皮細(xì)胞內(nèi)吞并清除。 首先用綠膿桿菌活菌刺激支氣管原代培育上皮細(xì)胞及A549細(xì)胞，活菌細(xì)胞共孵育兩小時(shí)后慶大霉素殺死細(xì)胞外的細(xì)菌，分別于實(shí)驗(yàn)4小時(shí)，24小時(shí)用TritonX-100裂解細(xì)胞，采用平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌在上皮細(xì)胞內(nèi)被逐漸減少，提示上皮細(xì)胞可以清除胞內(nèi)細(xì)菌。綠膿桿菌與細(xì)胞按不同比例共孵育兩小時(shí)后慶大霉素殺死未進(jìn)入胞內(nèi)的細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，酶聯(lián)免

3、疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-8的表達(dá)量，結(jié)果觀察到活菌可以刺激上皮細(xì)胞IL-8分泌增加。 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討了Nods蛋白是否參與上皮細(xì)胞清除細(xì)菌的過程，以及活菌在胞內(nèi)誘導(dǎo)IL-8分泌是否通過Nods受體信號(hào)。用超聲處理獲得綠膿桿菌菌體成，采用溫和去污劑digitonin處理A549細(xì)胞使細(xì)胞膜通透性增加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌菌體成分顯著誘導(dǎo)digitonin處理過的細(xì)胞IL-8表達(dá)水平，為對(duì)照的3倍，而未經(jīng)digitonin處理

4、的細(xì)胞IL-8表達(dá)水平增加不超過對(duì)照的1倍，提示菌體成分是胞內(nèi)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)有效的刺激物，胞內(nèi)模式識(shí)別受體Nod1，Nod2可能參與呼吸道上皮細(xì)胞的炎癥防御反應(yīng)。用RT-PCR檢測(cè)呼吸道上皮細(xì)胞Nod1，Nod2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞表達(dá)Nod1及Nod2。為了進(jìn)一步研究胞內(nèi)模式識(shí)別受體Nod1、Nod2是否參與細(xì)胞內(nèi)清除細(xì)菌的過程，構(gòu)建了Nod1及Nod2CARD結(jié)構(gòu)域缺失的突變重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變Nod2抑制了上

5、皮細(xì)胞清除胞內(nèi)細(xì)菌的能力，而突變Nod1對(duì)上皮細(xì)胞清除細(xì)菌的能力沒有影響。 我們進(jìn)一步假設(shè)，是否可以通過促進(jìn)細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的粘附而增強(qiáng)上皮細(xì)胞清除細(xì)菌。我們將人α-防御素(HNP)、克雷伯桿菌、上皮細(xì)胞共孵育四小時(shí)，采用平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞的活菌數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HNP顯著促進(jìn)細(xì)菌的粘附(增加12倍)。將HNP、克雷伯桿菌、細(xì)胞共孵育四小時(shí)后慶大霉素殺死未進(jìn)入胞內(nèi)的細(xì)菌，繼續(xù)孵育2小時(shí)，用TritonX-100裂解細(xì)胞，結(jié)果