角膜上皮抗真菌免疫過(guò)程中TLR2對(duì)NOD2的調(diào)控及NOD2的作用.pdf

1、真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是導(dǎo)致視力損傷甚至失明的重要原因。在全球范圍內(nèi)，約65％的角膜潰瘍是由真菌性角膜炎引起的。在農(nóng)業(yè)國(guó)家如中國(guó)和印度，角膜創(chuàng)傷是誘發(fā)真菌性角膜炎的主要原因。角膜創(chuàng)傷可以將真菌孢子直接帶入角膜基質(zhì)層，也可以通過(guò)破壞角膜上皮屏障的方式導(dǎo)致角膜直接暴露在致病性真菌前。其他誘因還包括免疫功能低下、皮質(zhì)類固醇使用史和角膜接觸鏡的佩戴。鐮刀菌屬和曲霉菌屬是導(dǎo)致真菌性角膜炎最主要的兩類病原體。大面積潰

2、瘍，前房積膿和曲霉菌感染往往是導(dǎo)致治療失敗的原因。此外，以往的研究表明，在曲霉菌性角膜炎患者中，42-60％需要進(jìn)行角膜移植術(shù)，而相比之下，鐮刀菌性角膜炎患者僅有23-32％需要進(jìn)行角膜移植術(shù)。因此在本研究中，我們選擇了煙曲霉菌（Aspergillus fumigates）作為角膜感染模型的病原體，具有重要的臨床意義。
　　已有文獻(xiàn)證實(shí)TLR2和NOD2在角膜上皮細(xì)胞中有基礎(chǔ)表達(dá);我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加熱滅活的煙曲霉菌孢子可以提高

3、TLR2和NOD2的表達(dá)。以往的研究還證實(shí)，TLR2在煙曲霉菌性角膜炎中起重要作用，其活化能激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)炎性因子如白介素(interleukin，IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α等的產(chǎn)生。鑒于TLR2和NOD2均能激活NFκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，我們意圖揭示TLR2和NOD2在永生化人角膜上皮細(xì)胞(human cornealepithelial cells，HCECs)抗

4、煙曲霉菌的過(guò)程中是否存在交叉對(duì)話;NOD2在HCECs抗煙曲霉菌免疫過(guò)程中是否發(fā)揮作用。我們的研究結(jié)果表明，酵母聚糖可通過(guò)依賴TLR2的途徑增加NOD2的表達(dá);使用酵母聚糖預(yù)處理可以減少M(fèi)DP引起的炎性細(xì)胞因子的分泌。此外，煙曲霉菌孢子也通過(guò)部分依賴TLR2的方式促進(jìn)NOD2和RIP2的表達(dá)。使用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)敲除NOD2后，煙曲霉菌孢子引起的炎性因子分泌減少。上述結(jié)果有助于我們加

5、深對(duì)真菌性角膜炎天然免疫機(jī)制的了解，揭示了NOD2在真菌性角膜炎中的作用，為真菌性角膜炎的治療指出新的研究方向。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 NOD2在HCECs中的表達(dá)
　　目的：
　　研究NOD2在HCECs中的基礎(chǔ)表達(dá)，及NOD2配體MDP、煙曲霉菌對(duì)NOD2表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞的獲取和培養(yǎng):HCECs由韋恩州立大學(xué)的Fu-Shin X.Yu教授慷慨提供

6、。細(xì)胞在37℃、含5％ CO2的濕潤(rùn)的細(xì)胞溫箱中孵育。細(xì)胞培養(yǎng)基采用新生牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)/F12與不含血清的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(keratinocyte serum free medium，KSFM)按照1∶1的比例配制而成。細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔微培養(yǎng)板上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.煙曲霉菌菌株的獲取和孢子的制備:煙曲霉菌

7、菌株CCTCC93024購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將菌種接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)4天。輕柔刮取培養(yǎng)基表面的孢子并在含0.05％Tween80的PBS(phosphate-buffered saline)中制備成孢子混懸液。使用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾該混懸液以達(dá)到去除煙曲霉菌菌絲和其他殘留物，提純孢子的目的。取過(guò)濾后的孢子混懸液，56℃加熱60min使孢子失活，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋制成1×105/ml的孢子混懸液。<

8、br>　　3.細(xì)胞的刺激:使用滅活的煙曲霉菌孢子(1×105/ml)刺激HCECs，經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞，熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chainreaction,RT-PCR)和western blotting檢測(cè)TLR2、NOD2的水平。使用NOD2的配體MDP(10μg/ml)刺激HCECs，經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞及培養(yǎng)上清，RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2

9、及下游關(guān)鍵分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌，免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NFκB-p65向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：
　　1.HCECs中TLR2與NOD2的mRNA和蛋白水平均在接受煙曲霉菌孢子刺激后有所提高。
　　2.使用MDP刺激HCECs后，NOD2及其下游關(guān)

10、鍵分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α表達(dá)均升高，NFκB-p65轉(zhuǎn)位入核增多，IL-6、IL-8和TNF-α分泌增加。
　　結(jié)論：
　　1.煙曲霉菌孢子可以上調(diào)HCECs中TLR2與NOD2的表達(dá)。
　　2.MDP可以激活NOD2及下游NFκB通路，提高炎性細(xì)胞因子的分泌水平。
　　第二部分 TLR2對(duì)NOD2在HCECs抗煙曲霉菌免疫中的表達(dá)和下游通路的影響
　　目的：
　　研究單純使用TL

11、R2配體酵母聚糖刺激HCECs對(duì)NOD2表達(dá)的影響，并驗(yàn)證上述影響是否通過(guò)TLR2發(fā)揮作用。研究酵母聚糖預(yù)處理對(duì)NOD2配體MDP、煙曲霉菌引起的NOD2通路激活的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞的刺激:使用不同濃度的酵母聚糖和經(jīng)熱堿處理過(guò)的酵母聚糖（10μg/ml，僅能被Dectin-1識(shí)別）分別刺激HCECs，經(jīng)12h或24h后收取細(xì)胞，RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2、RIP2的水平。使用不同

12、濃度的酵母聚糖預(yù)處理HCECs12h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃條件下MDP（10μg/ml）刺激12h或24h，收取細(xì)胞和培養(yǎng)上清，RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2、RIP2的表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌。
　　2.抗體阻斷:HCECs與抗人TLR2(100μg/ml)單克隆抗體共孵育4h后，更換培養(yǎng)液，37℃條件下滅活的煙曲霉菌孢子(1×105/ml)刺激12h或24h，

13、收取細(xì)胞及培養(yǎng)上清，RT-PCR和westem blotting檢測(cè)NOD2、RIP2的表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌，免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NFκB-p65向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
　　3.RNA干擾:利用GenBank庫(kù)查找NOD2 DNA中的三組目的序列，針對(duì)這三組序列，使用WI siRNA篩選程序(WI siRNAselection program)制作三條NOD2siRNA和一條用作對(duì)照的scram

14、ble siRNA(隨機(jī)打亂序列的RNA)。將細(xì)胞接種于6孔微培養(yǎng)板上，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到50-60％時(shí)，每孑L使用50nM siRNA，通過(guò)Lipofectamine2000試劑在Opti-MEM減血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h和12h后收取細(xì)胞使用RT-PCR和western blotting檢測(cè)NOD2及下游RIP2表達(dá)情況，確定敲減效果。選取敲減效果最佳的一條siRNA，轉(zhuǎn)染HCECs4h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃條件下滅活的煙曲

15、霉菌孢子(1×105/ml)刺激24h，收取培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌。
　　結(jié)果：
　　1.酵母聚糖刺激HCECs的最佳濃度是10μg/ml。該濃度的酵母聚糖刺激可有效提高HCECs中NOD2與RIP2的mRNA和蛋白水平，該作用可被TLR2抗體阻斷。經(jīng)熱堿處理過(guò)的酵母聚糖沒(méi)有這種作用。
　　2.酵母聚糖預(yù)處理HCECs的最佳濃度是10ng/ml。與單純使用MDP刺激相比，使用該濃度

16、的酵母聚糖預(yù)處理后，MDP引起NOD2、RIP2表達(dá)提高的能力下降，IL-6、IL-8和TNF-α的分泌減少。
　　3.使用抗體阻斷TLR2后，滅活的煙曲霉菌孢子引起NOD2及其下游關(guān)鍵分子RIP2、NFκB-p65和IκB-α表達(dá)升高的能力下降，NFκB-p65轉(zhuǎn)位入核減少，但仍高于空白對(duì)照組。
　　4.NOD2 siRNA可有效降低NOD2和RIP2的表達(dá)。敲減NOD2后，滅活的煙曲霉菌孢子刺激HCECs產(chǎn)生的IL-6、

17、IL-8和TNF-α減少，但仍多于空白對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1.酵母聚糖可以通過(guò)依賴TLR2的途徑上調(diào)HCECs中NOD2與RIP2的表達(dá)。
　　2.酵母聚糖預(yù)處理可能引起細(xì)胞的“交叉耐受”，即TLR2配體激發(fā)了細(xì)胞耐受性，降低了細(xì)胞對(duì)NOD2配體的反應(yīng)，從而使得后續(xù)MDP處理引起NOD2、RIP2表達(dá)提高的能力下降，炎性細(xì)胞因子分泌減少。
　　3.與酵母聚糖相似，煙曲霉菌孢子也通過(guò)部分依賴TLR2的途徑上調(diào)