Dectin-1與TLR2在真菌感染人角膜上皮細(xì)胞固有免疫階段的關(guān)系.pdf

1、Dectin1與TLI也在真菌感染人角膜上皮細(xì)胞固有免疫階段的關(guān)系摘要目的：研究人永生化角膜上皮細(xì)胞(THCE)感染煙曲霉菌菌絲抗原后，THCE細(xì)胞表面Dectin1和TLR2的表達(dá)情況，兩者在固有免疫階段的關(guān)系，及其對趨化因子的影響。方法：常規(guī)體外培養(yǎng)的THCE細(xì)胞為空白對照組，實(shí)驗(yàn)組又分為真菌刺激組和通路受體阻斷組，用煙曲霉菌菌絲抗原感染體外培養(yǎng)的THCE細(xì)胞，建立真菌感染的THCE細(xì)胞模型，此為真菌刺激組，通路受體阻斷組分別用De

2、ctin1阻斷劑(1aminarin)和TLR2中和抗體預(yù)先處理THCE細(xì)胞30分鐘，后加入煙曲霉菌菌絲抗原刺激液，此為Dectin1阻斷真菌刺激組和TLR2阻斷真菌刺激組，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime—PCR)檢測4h、8h、16hTHCE細(xì)胞Dectin1、TLR2、CXCLl、CXCL8mRNA的表達(dá)；于8h、16h、24h行Westernblot檢測THCE細(xì)胞Dectin1、TLR2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：Dectin1

3、、TLR2mRNA在真菌菌絲抗原刺激THCE細(xì)胞后4h表達(dá)升高，8h達(dá)高峰，真菌菌絲抗原刺激后8h組與4h、16h組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO05)；在真菌菌絲抗原刺激THCE細(xì)胞后8h，Dectin1、TLR2蛋白表達(dá)均升高，16h表達(dá)量達(dá)峰值。趨化因子(CXCLl、CXCL8)的升高趨勢與Dectin1和TLR2的表達(dá)趨勢一致。laminarin阻斷Dectin1后，真菌菌絲抗原刺激THCE細(xì)胞8h，TLR2mRNA表達(dá)明顯下降

4、(PO05)，而TLR2蛋白在Dectin1被阻斷后16h后，表達(dá)也相應(yīng)下降(P005)；TLR2中和抗體阻斷TLR2后真菌菌絲抗原刺激THCE細(xì)胞8h，Dectin一1mRNA表達(dá)明顯下降(P005)，其蛋白表達(dá)量在阻斷TLR2后真菌菌絲抗原刺激16h減少(PO05)。阻斷Dectin一1與阻斷TLR2受體，趨化因子(CXCLl、CXCL8)的表達(dá)量均受到明顯抑制(P005)。結(jié)論：TLR2和Dectin1共同參與了THCE細(xì)胞對煙曲

5、霉菌菌絲抗原體的識別，兩者在人角膜上皮細(xì)胞抗真菌感染固有免疫階段存在相互作用，均引起下游趨化因子(CXCLl，CXCL8)的產(chǎn)生，介導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。碩士研究生李青(眼科學(xué))指導(dǎo)教師趙桂秋教授關(guān)鍵字：趨化因子；Dectin1；真菌性角膜炎；關(guān)系；TLR2目錄引言1第一章材料和方法311實(shí)驗(yàn)材料3111實(shí)驗(yàn)對象3112實(shí)驗(yàn)主要儀器與設(shè)備3113實(shí)驗(yàn)主要耗材和試劑3114常用液體的配制及消毒512實(shí)驗(yàn)方法6121細(xì)胞培養(yǎng)6122煙曲

6、霉菌培養(yǎng)及菌絲抗原刺激液的制備8123煙曲霉菌菌絲抗原刺激實(shí)驗(yàn)8124Dectin1阻斷實(shí)驗(yàn)一9125TLR2阻斷實(shí)驗(yàn)一9126Real—timePCR實(shí)驗(yàn)9127Westernblot實(shí)驗(yàn)12128實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取1613統(tǒng)計(jì)學(xué)方法16第二章結(jié)果1721煙曲霉菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果1722永生化人角膜上皮細(xì)胞(THCE)的形態(tài)學(xué)觀察1723煙曲霉菌菌絲抗原刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果17231RealtimePCR結(jié)果17232Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)