人角膜緣上皮細胞建系的研究.pdf

1、目的：通過體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，建立具有正常生物學特性和功能的人角膜緣上皮細胞系，為角膜上皮細胞的研究和組織工程化角膜的構建提供種子細胞。 方法：取材中山眼科中心角膜移植術后剩余的無菌角膜緣組織，利用消化培養(yǎng)法，組織塊培養(yǎng)法和飼養(yǎng)層培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)和純化人角膜緣上皮細胞。經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)，建立人角膜緣上皮細胞系。通過下列方法進行細胞系的鑒定：①通過光鏡、電鏡，觀察細胞在傳代過程中形態(tài)學特征，用常規(guī)方法進行細胞凍存和復蘇，觀察復蘇效率

2、；②通過MTT法繪制細胞生長曲線，計算群體倍增時間，掌握其生長和增殖規(guī)律；③通過有限稀釋法檢測細胞的克隆形成力，并挑取單克隆，體外擴增和純化細胞系；④通過流式細胞技術進行細胞DNA倍體分析及周期檢測，觀察傳代細胞DNA和細胞周期的變化；⑤通過間接免疫熒光細胞染色、westem blot、反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等方法檢測細胞蛋白表達：包括轉錄因子P63，角膜上皮細胞特異性蛋白角質蛋白(cytokeratin)CK3和CK12

3、的表達，同時檢測CK19，CK14，波形蛋白(Vimentin)，微絲蛋白(F-actin)，微管蛋白(β-tubilin)和β1整合素(β1-integrin)等蛋白在細胞系中的表達情況；⑥對染色體進行核型分析，觀察細胞在傳代過程中核型的變化；⑦利用雙瓊脂細胞克隆形成實驗對細胞進行固著非依賴性生長分析(Anchorage independentgrowth assay)；將不同代數(shù)角膜緣上皮細胞接種到Balb/c裸小鼠皮下組織，觀察有

4、無致瘤性，評價細胞的生物安全性；⑧將細胞接種在Transwell培養(yǎng)皿中進行氣液界面培養(yǎng)2周，觀察細胞系的體外復層形成能力。 結果：采用組織塊培養(yǎng)法成功建立了一株人角膜緣上皮細胞系(spontaneously derived human corneal epithelial cell line-SDHCEC1)。細胞在體外連續(xù)傳代已超過50代，經(jīng)過鑒定后，細胞系具有以下特征：①形態(tài)特點：細胞呈圓形、橢圓形，細胞表面可見豐富的微絨

5、毛。細胞漿內(nèi)可見大量的粗面內(nèi)質網(wǎng)，核糖體，微絲和微管等細胞合成、分泌旺盛的上皮細胞表征。按照常規(guī)方法進行保存的細胞在-196℃凍存6個月之后，復蘇后活細胞比率大于85﹪。②細胞生長動力學分析：細胞倍增時間為19.6小時，細胞在接種后24小時后進入對數(shù)生長期，細胞增殖旺盛，狀態(tài)良好。③克隆特點及形成率：體外培養(yǎng)的人角膜緣上皮細胞的克隆形成率維持在5-6﹪左右。早代細胞(P<10代)形成的克隆小而緊密，后代細胞的克隆則比較松散，細胞的遷移性

6、增加。④細胞在傳代培養(yǎng)過程中，S期細胞的比例分別為23.2﹪、7.5﹪、6.1﹪、17.5﹪、11.4﹪、7.7﹪(P1-P50每隔十代)；DNA倍體分析表明細胞DNA含量向多倍體和異倍體發(fā)展。⑤SDHCEC1細胞表達角膜上皮細胞特異性蛋白CK3和CK12，同時還表達角膜緣上皮細胞的其他蛋白如CK19、CK14、Vimentin、F-actin，β-tubilin和β<,1>-integrin蛋白，而無P63蛋白的表達。⑥核型分析表明：

7、細胞系的染色體核型為多倍體，異倍體，染色體在細胞長期傳代培養(yǎng)過程中發(fā)生了斷裂和重組。⑦SDHCEC1細胞和陰性對照組P3人角膜緣上皮細胞在雙瓊脂克隆形成實驗中均不能形成有效克隆(單克隆細胞數(shù)>5)，而33.2﹪視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞-RB細胞(陽性對照組)在相同的條件下中可以形成有效克隆。細胞接種于裸鼠皮下80天后，未見有腫瘤生長。⑧采用氣液界面培養(yǎng)法培養(yǎng)SDHCEC1細胞2周，可形成3-4層復層角膜上皮。 結論：采用組織塊培養(yǎng)法

8、，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，結合人角膜緣上皮細胞在傳代培養(yǎng)不同時期的生長特點改良培養(yǎng)技術，成功建立了一株人角膜緣上皮細胞系-SDHCEC1。SDHCEC1細胞系的建立避免了對細胞的基因操作，細胞在體外長期傳代的過程中能夠保持角膜上皮細胞的形態(tài)學、生長動力學、蛋白表達和復層形成能力，并且細胞系安全無致瘤性。為角膜上皮細胞增殖和分化的基因調(diào)控，細胞外基質的合成，生長因子的作用，藥物的開發(fā)和毒性檢測等角膜上皮細胞的研究提供細胞來源，也可為構建組織工程