培養(yǎng)的兔角膜緣上皮細(xì)胞深低溫保存后的生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:通過(guò)對(duì)培養(yǎng)后的角膜緣上皮細(xì)胞進(jìn)行深低溫保存,檢測(cè)復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,來(lái)探討深低溫保存角膜緣上皮細(xì)胞的可行性和效果.方法:實(shí)驗(yàn)室階段:(1)角膜緣上皮細(xì)胞的培養(yǎng):將切取的兔角膜緣組織剪成1mm×1mm小組織塊,經(jīng)消化酶處理后培養(yǎng)在12孔板中,培養(yǎng)細(xì)胞至形成單層;(2)角膜緣上皮細(xì)胞的深低溫保存和復(fù)蘇:形成單層的細(xì)胞消化后制成懸液,分別用兩組冷凍保護(hù)液:A組為32.5％F12+32.5%DMEM+20%小牛血清+15%甘油;B組為

2、90%小牛血清+10%二甲基亞砜(DMSO)按階段降溫保存在液氮里,凍存半月、1月和2月分批取出,進(jìn)行復(fù)溫和復(fù)溫后處理;(3)深低溫保存前后的角膜緣上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和鑒定:將未冷凍的細(xì)胞和不同凍存時(shí)間、不同凍存保護(hù)液的冷凍復(fù)蘇后細(xì)胞制成的懸液傳代至無(wú)上皮細(xì)胞的羊膜上再培養(yǎng),采用免疫組化、電鏡鑒定培養(yǎng)后細(xì)胞的性質(zhì);(4)深低溫保存前后的角膜緣上皮細(xì)胞活性比較:通過(guò)倒置顯微鏡、電鏡、MTT比色法、臺(tái)盼蘭染色來(lái)比較傳代培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞深

3、低溫保存前后的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段:將40只角膜緣干細(xì)胞損傷的模型兔隨機(jī)分成單純羊膜組、未冷凍細(xì)胞組、DMSO保存細(xì)胞組和甘油保存細(xì)胞組,每組10只,用傳代培養(yǎng)2周后的角膜緣上皮細(xì)胞作移植實(shí)驗(yàn),觀察細(xì)胞體外功能完成情況來(lái)進(jìn)一步比較深低溫保存前后角膜緣上皮細(xì)胞的活性.結(jié)論:角膜緣上皮細(xì)胞深低溫保存后仍保持上皮細(xì)胞特性,傳代培養(yǎng)后細(xì)胞中含有較多有高增殖力的干細(xì)胞;DMSO保護(hù)液比甘油保護(hù)液低溫保存效果好;角膜緣上皮細(xì)胞經(jīng)階段降