小鼠角膜上皮細(xì)胞的長期培養(yǎng)及組織工程化角膜上皮構(gòu)建.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文小鼠角膜上皮細(xì)胞的長期培養(yǎng)及組織工程化角膜上皮構(gòu)建姓名：馬小力申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：張勁松20080301分別在RNA水平和蛋白水平，對不同培養(yǎng)條件下的小鼠角膜上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞標(biāo)記(p63和角蛋白19抗體)及分化標(biāo)記(involucrin和角蛋白12)的表達(dá)情況進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確培養(yǎng)的小鼠角膜上皮細(xì)胞的分化表型和分化特征，為小鼠角膜上皮干細(xì)胞和干細(xì)胞龕的研究提供試驗支持和理論依據(jù)。’為構(gòu)建組織

2、工程化小鼠角膜上皮，本研究首創(chuàng)性地提出了73“1“3復(fù)式滋養(yǎng)層培養(yǎng)的方法，對不同的三維培養(yǎng)系統(tǒng)(3T3接觸滋養(yǎng)層培養(yǎng)、3T3分離滋養(yǎng)層培養(yǎng)、3T3復(fù)式滋養(yǎng)層培養(yǎng)和無滋養(yǎng)層培養(yǎng))進(jìn)行比較研究，以創(chuàng)建更接近活體角膜上皮的理想模型，用于角膜干細(xì)胞和干細(xì)胞龕的研究，并探索構(gòu)建組織工程化角膜上皮的最優(yōu)方案。材料與方法第一部分小鼠角膜上皮干細(xì)胞的長期培養(yǎng)通過比較SHEM培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法、KSFM培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法、SHEM培養(yǎng)液中組織塊培

3、養(yǎng)法培和KSFM培養(yǎng)液中組織塊培養(yǎng)法等4種培養(yǎng)方法，進(jìn)行小鼠角膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。在第四代(P4)前，小鼠角膜上皮細(xì)胞半融合或復(fù)層化后，以1：3的比例傳代。從P5開始，細(xì)胞半融合后以5x104／75CM2培養(yǎng)瓶的接種密度進(jìn)行培養(yǎng)。在整個培養(yǎng)過程中，始終保持不同個體來源的細(xì)胞相互分離培養(yǎng)。并測定克隆形成率(ColonyFormingEfficiencyCFE)、群體倍增值(PopulationDoublings。PDs)、群體倍增時間(

4、DoublingTimes，Tds)及繪制生長曲線。第二部分小鼠角膜上皮細(xì)胞的表型鑒定及誘導(dǎo)分化利用RTPCR、WesternBlotting和免疫細(xì)胞化學(xué)方法，以培養(yǎng)的小鼠角膜上皮細(xì)胞為研究對象，測定角膜上皮祖細(xì)胞標(biāo)記p63和角蛋白19以及分化標(biāo)記蛋白角蛋白12和Involucrin的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。并分別在KSFM、含0graM鈣離子的KSFM、含10％胎牛血清(FBS)的KSFM，含10％FBS及09ram鈣離子的KSFM