超薄羊膜載體的制備及其在構建組織工程角膜上皮中的應用.pdf

1、目的:羊膜是目前應用最廣泛的構建組織工程角膜上皮的載體。但在臨床應用中發(fā)現(xiàn)，基于羊膜構建的組織工程角膜上皮在移植術后角膜的透明度恢復并不理想。目前認為，羊膜基質(zhì)的纖維細胞層及疏松的海綿層可能是影響羊膜透明度的主要原因。因此，本研究對傳統(tǒng)去上皮羊膜（DAM）進行改造，制備一種新型的超薄羊膜(UAM)載體，并評估其生物學及光學性質(zhì)，同時探討使用該種載體構建組織工程角膜上皮的可行性。
　　方法:本研究利用0.02％的EDTA去除失活羊膜

2、組織的上皮細胞，并采用Ⅳ型膠原酶消化去除羊膜基質(zhì)的纖維層及海綿層，從而獲得羊膜致密層。比較從不同位置來源的胎兒面及胎盤面羊膜，選擇合適的羊膜來源。以傳統(tǒng)的完整羊膜(IAM)及DAM為對照組，探討UAM的物理及生物學特性，包括光學透明度、組織結構、脫細胞程度、超微結構，并通過對Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅶ型膠原、Lamnin5及Perlacan進行免疫熒光及組化染色分析UAM的生物成分。在此基礎上，采用UAM作為載體構建組織工程角膜上皮，并觀察角

3、膜上皮片的超微結構，利用western blot、RT-PCR以及免疫熒光染色分析細胞表型(K3、K14、K12、p63、ABCG2)、細胞連接(Connexin43、Claudin-1、β-Catenin、Occludin、E-cadherin)及抗新生血管(TIMP-1、thrombospondin-1)相關標記物的表達情況。最后，采用該組織工程角膜上皮移植治療模型動物的全角膜緣干細胞缺乏。術后觀察移植細胞的存活、眼表的上皮化、炎癥

4、以及角膜新生血管形成情況等，并觀察移植術后2周角膜上皮的組織結構及細胞表型變化。
　　結果:UAM是一種透明、脫細胞、膠原纖維排列致密的材料，厚度約20-30μm左右，主要含有Ⅰ型和Ⅲ型膠原及部分基底膜Laminin5成分?；赨AM構建的角膜上皮片較傳統(tǒng)的DAM載體構建的角膜上皮片厚度更厚且透明度更佳。同時，在UAM上培養(yǎng)的角膜上皮細胞與其底層的羊膜載體貼附緊密，且表達更多的p63、ABCG2、β-catenin、TIMP-1、

5、thrombospondin-1等角膜上皮祖細胞、緊密連接及抗新生血管相關的標記物。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)移植術后2周，基于UAM構建的組織工程角膜上皮可成功治療全角膜緣干細胞缺乏動物模型。移植術后2周發(fā)現(xiàn)，UAM移植組較DAM移植組角膜上皮細胞復層化及透明度更好。
　　結論:基于UAM構建的組織工程角膜上皮透明度較好，同時在其表面擴增的角膜緣干細胞能夠維持角膜緣組織的正常細胞表型，移植術后效果也更佳。UAM保留了完整的羊膜致密層結構