組織工程板層角膜構(gòu)建與整體功能重建的實驗研究.pdf

1、第一章、UC-MSCs分化為角膜上皮細胞的實驗研究
　　 目的:探討在體外條件下誘導(dǎo)UC-MSCs（臍帶間充質(zhì)干細胞）分化為角膜上皮細胞的可行性。
　　 方法:消化法分離培養(yǎng)UC-MSCs細胞，流式細胞技術(shù)檢測細胞表型、細胞周期，MTT檢測細胞生長增殖能力。將UC-MSCs在不同濃度的EGF(5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml)下培養(yǎng)，觀察EGF能否誘導(dǎo)UC-MSCs分化為角膜上皮細胞。確定細胞分化的最佳時間。

2、同時，將UC-MSCs與兔角膜上皮細胞共培養(yǎng)，觀察分化情況，免疫組化檢測角膜上皮相關(guān)蛋白的表達。
　　 結(jié)果:采用消化法可以在體外條件下成功地分離培養(yǎng)UC-MSCs，其表達CD29、CD34，細胞保持著較旺盛的增殖能力。在15ng/ml EGF處理30天的條件下，UC-MSCs可以部分表達角膜上皮細胞的標記K3; UC-MSCs在與角膜上皮細胞共培養(yǎng)2周后，UC-MSCs細胞可以檢測到K3、ABCG2與P63的部分表達。

3、　　 結(jié)論:體外條件下，采用共培養(yǎng)的方法可以誘導(dǎo)UC-MSCs分化為角膜上皮細胞。
　　 第二章、利用核酸酶聯(lián)合低溫電泳制備脫細胞豬角膜基質(zhì)
　　 目的:探索使用核酸酶聯(lián)合低溫電泳制備的脫細胞豬角膜基質(zhì)(Decellularized porcine comeal matrix，DPCM)作為生物角膜支架材料的可行性。
　　 方法:去除豬角膜上皮與內(nèi)皮細胞之后，使用17 U/mL DNase I處理正常豬角膜(N

4、ative porcine comea,NPC)，利用低溫電泳清除殘留的細胞與DNA碎片，制備DPCM，并對制備的DPCM進行相關(guān)的生物學(xué)與物理學(xué)特性的評價。主要有:檢測DPCM的大體形態(tài)、組織學(xué)特點、去細胞效率、DNA含量、蛋白多糖、超微結(jié)構(gòu)的改變;檢測DPCM的透光率、生物相容性;DPCM浸提液對角膜上皮細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞增殖活性的影響。
　　 結(jié)果:通過核酸酶聯(lián)合低溫電泳的脫細胞方法可以成功去除NPC中96.43％的

5、DNA成分，保留了92％的氨基葡聚糖成分;而且DPCM中膠原纖維的超微結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的變化;在300-800nm波長范圍內(nèi)，DPCM的透光率與NPC沒有顯著差異;DPCM保持了良好的生物力學(xué)特點;皮下移植試驗沒有觀察到炎癥細胞浸潤的現(xiàn)象;DPCM浸提液對角膜上皮細胞、基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞的增殖活性沒有影響。
　　 結(jié)論:使用核酸酶聯(lián)合低溫電泳的脫細胞方法有效地清除了細胞成分，良好地保存了角膜基質(zhì)的精密超微結(jié)構(gòu)，保留了膠原纖維的有

6、序排列，儲備了92％的蛋白多糖成分。該方法脫細胞效率明顯，特異性強;DPCM具有高度的透明性、極低的免疫原性、良好的生物相容性、足夠的生物力學(xué)強度和長期的生物穩(wěn)定性。
　　 第三章、組織工程板層角膜的構(gòu)建與體內(nèi)移植
　　 目的:利用DPCM為載體，為UC-MSCs提供生長的微環(huán)境，構(gòu)建組織工程化板層角膜(Tissue engineering lamellar cornea，TELC)，并評價其整體功能。
　　 方

7、法:將UC-MSCs接種在DPCM上，體外培養(yǎng)1、2、3周后，在各時間點取材對構(gòu)建的TELC進行HE染色觀察其組織結(jié)構(gòu)特點，透射電鏡檢測細胞連接形成的情況;免疫熒光檢測K3、ZO-1、Cadherin、integrinβ4、LN、FN等蛋白的表達情況;通過新西蘭大白兔的體內(nèi)板層角膜移植(lamellar keratoplasty，LKP)實驗，評價TELC的整體功能:植片上皮化時間、透明性、透光率、生物學(xué)相容性、術(shù)后愈合情況等。

8、　　 結(jié)果: UC-MSCs可以在DPCM上生長，并被誘導(dǎo)分化為角膜上皮細胞。在體外構(gòu)建過程中，12天可以形成具備3-4層上皮細胞的TELC。該材料上的細胞已經(jīng)具備明顯的黏附、增殖和形成復(fù)層上皮的能力。體內(nèi)移植后，DPCM組上皮化的時間大約為7±2天，完全透明的時間為30±5天。與DPCM組相比，TELC組術(shù)后第一天就達到了完全上皮化，熒光素鈉染色陰性，植片透明。在300-800nm波長范圍內(nèi)，TELC組比DPCM組的透光率略有增強。