組織工程角膜的體外構(gòu)建及移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、取少量健康的自體角膜組織，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后種植于一種生物相容性良好的載體上，形成結(jié)構(gòu)和功能與在體角膜相似的組織工程角膜，移植到患眼，不但解決了角膜供體來源不足的問題而且不存在免疫排斥反應(yīng)。組織工程化角膜以其低抗源性、來源不受限、可按預(yù)先設(shè)計(jì)塑型、具有生物活性等特征為臨床應(yīng)用提供了廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)制備豬去細(xì)胞角膜基質(zhì)材料(PACM)，對(duì)此材料的生物相容性、活體內(nèi)移植進(jìn)行觀察；進(jìn)一步研究在體外構(gòu)建含細(xì)胞組織工程角膜基質(zhì)的方法，并將構(gòu)建的含細(xì)

2、胞組織工程角膜基質(zhì)進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。 一、豬去細(xì)胞角膜基質(zhì)材料的制備及其生物相容性 檢測(cè)用三種不同的方法制備豬去細(xì)胞角膜基質(zhì)材料，以找到一種較理想的制備方法和支架材料：以豬角膜為材料來源，分別用Triton(曲拉通)聯(lián)合0.25％胰酶、Triton聯(lián)合DNA-RNA酶、Triton聯(lián)合0.25％胰酶及DNA-RNA酶消化去細(xì)胞，進(jìn)HE染色、掃描電鏡觀察；在材料上接種兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行HE染色觀察。 結(jié)果：Trito

3、n聯(lián)合0.25％胰酶、DNA-RNA酶消化去細(xì)胞方法最佳，時(shí)間為4h。經(jīng)HE染色、掃描電鏡觀察證實(shí)：此方法制備的PACM細(xì)胞去除完全，呈三維立體網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀間隙明顯增大，平均為200um左右。兔角膜基質(zhì)細(xì)胞接種在PACM上后12h開始伸展并緊密貼附，細(xì)胞狀態(tài)良好，4～5d鋪滿直徑6mm的材料表面。而另外兩種方法制備的PACM細(xì)胞去除不完全，網(wǎng)狀間隙無明顯增大，接種兔角膜基質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞不能很好的伸展，3～4d死亡。 分別將P

4、ACM和豬新鮮角膜基質(zhì)植入兔皮下，1～8w時(shí)間內(nèi)分別取材用HE染色觀察；再將PACM植入兔角膜基質(zhì)囊袋內(nèi)，用裂隙燈、HE染色觀察。結(jié)果：PACM植入兔皮下，僅在4w時(shí)發(fā)生短暫的炎癥反應(yīng)，未見明顯的免疫排斥；而新鮮豬角膜基質(zhì)1～8w時(shí)間內(nèi)炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，發(fā)生了免疫排斥。PACM植入兔角膜基質(zhì)囊袋中觀察：無明顯的免疫排斥反應(yīng)發(fā)生，8w時(shí)PACM開始逐漸變薄，有透明趨勢(shì)。最長觀察到10m，PACM在角膜基質(zhì)內(nèi)幾乎完全透明。故PACM具有良好

5、的生物相容性。 二、豬去細(xì)胞角膜基質(zhì)材料(PACM)的動(dòng)物體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn) 1.PACM對(duì)角膜重度堿燒傷進(jìn)行移植分別采用PACM和甘油保存的兔板層角膜對(duì)兔角膜重度堿燒傷進(jìn)行角膜移植治療。術(shù)后用裂隙燈、HE染色觀察。PACM移植早期(≤3w)有炎癥反應(yīng)，但較非手術(shù)治療組炎癥反應(yīng)輕，僅局限于角膜板層，未侵及角膜全層。6w，炎癥基本靜止，眼表恢復(fù)接近正常。觀察長達(dá)10m，術(shù)眼一直處于相對(duì)安靜狀態(tài)，角膜半透明或基本透明。HE染色：術(shù)

6、后6～7w，PACM周圍的炎細(xì)胞浸潤已明顯減輕，新生血管明顯減少，角膜基質(zhì)纖維排列較早期規(guī)則并有角膜基質(zhì)細(xì)胞開始向PACM周邊長入。術(shù)后11w，可見PACM與兔角膜基質(zhì)融合良好，其間無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，并有角膜基質(zhì)細(xì)胞長入。故PACM可以有效的阻止堿燒傷后的炎癥反應(yīng)，修復(fù)角膜損傷，防止了進(jìn)一步的角膜潰瘍、穿孔的發(fā)生，恢復(fù)了眼表相對(duì)正常的結(jié)構(gòu)，達(dá)到了臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)。其療效與甘油保存的兔角膜相同。 2.PACM對(duì)細(xì)菌性角膜潰瘍進(jìn)行移植

7、分別采用PACM和甘油保存的兔板層角膜對(duì)兔細(xì)菌性角膜潰瘍進(jìn)行移植。術(shù)后進(jìn)行裂隙燈、HE染色觀察。PACM移植術(shù)后2～3w，角膜上皮開始修復(fù)，角膜緣有新生血管侵入植片邊緣。4～5w，植片新生血管、水腫開始減退。6w，角膜植片新生血管明顯減少，水腫消失，整個(gè)角膜上皮完全修復(fù)，植片局部開始透明。8～10w，角膜植片已無明顯的新生血管浸潤，基本透明。組織學(xué)證實(shí)：術(shù)后8w，PACM周圍無炎細(xì)胞浸潤，與角膜基質(zhì)組織融合生長良好。觀察長達(dá)10m，PA

8、CM基本完全與角膜基質(zhì)組織融合，改建為正常兔角膜基質(zhì)組織，再生的膠原纖維排列規(guī)則、緊密。故PACM可修復(fù)角膜潰瘍并改建透明。 三、含細(xì)胞組織工程角膜基質(zhì)的體外構(gòu)建及動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn) 利用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建角膜基質(zhì)層：以兔角膜基質(zhì)作為細(xì)胞來源，用消化法獲得兔角膜基質(zhì)細(xì)胞并用PKH26進(jìn)行熒光標(biāo)記，將其接種在PACM上，構(gòu)建出含細(xì)胞組織工程角膜基質(zhì)。用所構(gòu)建的含細(xì)胞組織工程角膜基質(zhì)修復(fù)細(xì)菌性角膜潰瘍。術(shù)后進(jìn)行裂隙燈、HE染色、